七氟醚减轻蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤

张 敏，邢丹丹，康文越，林 慧

(海南省人民医院 海南医学院附属海南医院 麻醉科，海南 海口 570000)

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)由外伤、高血压、脑动脉畸形及动脉瘤等因素诱发造成，是一种出血性卒中，具有极高的病死率和致残率[1]。早期脑损伤(early brain injury, EBI)是SAH后高致死、致残率的主要原因，包括SAH后脑水肿、血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)破坏、神经细胞的凋亡等病理变化[2-3]。挥发性麻醉气体，例如异氟烷和七氟醚(sevoflurane, Sev)，已经在各种类型的脑损伤中被发现具有神经保护作用，如创伤性脑损伤、卒中、脑缺血/再灌注损伤和神经退行性疾病，包括SAH[4]。

Sev是最常用的挥发性麻醉剂之一，在手术中通过吸入进行诱导和维持麻醉。据报道，Sev可通过降低SAH患者脑脊液caspase-3水平，减缓神经元凋亡，减轻SAH后EBI[5]；动物研究也证实在SAH后24 h，给予1.5%的Sev 60 min和3%的Sev 30、60 min，可改善小鼠的神经行为功能、脑水肿并减轻神经元死亡[6]。这提示，Sev对SAH后EBI具有显著的保护作用；但其发挥保护作用的具体机制尚不完全明确。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路在中枢神经系统的发育中起着重要的作用。据报道，Wnt/β-catenin信号通路的失活与SAH诱导的神经细胞凋亡有关[7]；而且激活Wnt/β-catenin信号通路可显著改善SAH后的神经行为功能并减轻BBB渗漏，保持BBB完整性[8]。Sev对SAH后EBI的保护作用是否与Wnt/β-catenin信号通路有关尚还未可知；因此，本研究拟探讨Sev对SAH大鼠EBI的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：6-8周龄SPF级SD雄性大鼠90只，体质量(280±20)g[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证为SCXK(京)2019-0009]。

1.1.2 药品、试剂：Sev(上海恒瑞医药有限公司)；Dickkopf-1(DKK1，Wnt/β-catenin通路特异性抑制剂)(北京爱必信生物技术有限公司)；伊文思蓝(Evan blue, EB)染色液(南京沃博生物科技有限公司)；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)、RIPA裂解液、BCA试剂盒(上海碧云天生物科技公司)；兔抗Wnt3a、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、β-catenin、紧密连接蛋白(zonula occludens-1, ZO-1)和claudin-5、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)、occludin、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、β-actin、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：大鼠适应性饲养3 d后，随机分为假手术组(sham组)、模型组(model组)，Sev低(Sev-L，1.5%)、高剂量组(Sev-H，3%)、Sev+DKK1组(Sev 3%+DKK1 5 μg/kg)[6]，每组18只。按照参考文献[9]采用血管内穿刺法建立SAH大鼠模型，具体操作为：大鼠麻醉后，于颈部正中切一小口，暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。将一4-0尼龙缝合线通过颈外动脉插入颈内动脉，推进约3 cm后感觉到有阻力时，继续将缝合线进一步推进以刺穿血管。恢复颈内动脉血流，血液便可经过穿刺口进入蛛网膜下腔，缝合颈部皮肤切口。Sev+DKK1组大鼠在模型制备前30 min，侧脑室注射5 μg/kg DKK1；Sham组仅插入缝合线，不刺破血管。模型成功标准：1)有明显的血管刺破感；2)大鼠有呼吸急促、心率加快的症状出现。3)剥离脑组织后可观察到血液散布在脑底和环池等部位。造模过程中死亡和造模失败大鼠给予补充。

在SAH诱导后1 h，Sev各剂量组和Sev+DKK1组使用小动物呼吸麻醉机面罩吸入Sev(体积分数1.5%、3%)与氧气的混合气体，连续吸入给药1 h；sham组和model组单纯吸入氧气1 h；麻醉结束后将大鼠置于笼子中至苏醒。

1.2.2 神经功能评分：在SAH后24 h对神经功能进行评分，使用改良的Garcia量表。修改后的Garcia量表(最高评分18分)包括本体触感、触须反应、自主活动、四肢对称运动、攀爬能力和前肢伸展运动；每个子测试的得分从0(最低)到3(最高)。评分越高代表神经功能越好。

1.2.3 伊文思蓝(EB)检测血脑屏障通透性：每组随机选取6只大鼠，麻醉后，尾静脉注入2%伊文思蓝(EB)溶液(5 mL/kg)，6 h后行心脏PBS灌注取脑，仔细分离并去除大脑硬脑膜、小脑以及脑干。精确称取脑组织，加入2 mL三氯乙酸溶液匀浆，静置30 min，14 000 r/min离心30 min，取等量上清液(0.8 mL)，用酶标仪在620 nm波长处测定吸光度(A)值，利用样品作出标准曲线，根据标准曲线求得EB含量(μg/g脑组织)。EB含量的增大，表示BBB被破坏，通透性增加。

1.2.4 蛛网膜下腔出血评分(SAH评分)：每组剩余12只大鼠，通过SAH分级系统评估SAH的严重程度。取出大脑拍照，将大脑底部的照片分为6个部分，根据蛛网膜下腔血的量对其进行评分(0～3分)，计算总得分(6个部位分数相加)。评分标准：0分：未见出血；1分：极少量凝血块；2分：中等量蛛网膜下腔出血，但仍可看清血管；3分：大量蛛网膜下腔出血，血管难以辨认。

1.2.5 脑含水量(brain water content, BWC)的检测：从每组剩余的12只大鼠中随机选取6只，去除大脑硬脑膜、小脑以及脑干，0.9%氯化钠溶液冲洗残留血迹后，滤纸吸干表面水分，称重(湿重)。然后，将脑组织在烤箱中干燥72 h，再次称重(干重)。计算出BWC的百分比(BWC=[湿重-干重]/湿重)×100%。

1.2.6 TUNEL免疫荧光染色检测神经元凋亡：每组剩余的6只大鼠，将脑组织冠状切分为两部分，一部分液氮速冻后，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot实验，另一部分在室温下置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，切片，将切片与蛋白酶K溶液在37 ℃孵育10 min，再用0.3% H2O2处理10 min，与TUNEL反应混合物(绿色荧光)在黑暗中于37 ℃孵育60 min。PBS洗涤后与DAPI一起孵育5 min。使用荧光显微镜在颞叶皮层5个随机视野中对TUNEL阳性细胞核的数目进行计数。通过比较TUNEL阳性细胞的数目和DAPI阳性细胞的数目确定神经元凋亡。

1.2.7 Western blot检测脑组织Wnt/β-catenin信号通路、BBB及凋亡相关蛋白的表达：取出-80 ℃冰箱保存的脑组织，剥离颞叶皮层，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，静置后离心，提取上清液为总蛋白溶液。用BCA法测量蛋白浓度后，将样品与上样缓冲液混合并在100 ℃下加热变性5 min，取等量样品(30 μg/孔)上样。SDS-PAGE，湿转法转膜，封闭后将膜与一抗(Wnt3a、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、occludin、ZO-1、claudin-5、MMP-9、Bcl-2、Bax，1∶1 000；β-actin，1∶5 000)4 ℃下孵育过夜，然后与HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL显色，以β-actin为内参，通过与内参的吸光度比值，得出目的条带的相对表达水平。

1.3 统计学分析

所有数据分析均使用SPSS 21.0软件进行。将符合正态分布的测量数据以均值±标准差(x±s)表示。单因素方差分析(one way Anova)用于多组之间的比较，Tukey的事后检验用于单因素方差分析后的成对比较。

2 结果

2.1 各组大鼠的神经功能评分

与sham组相比，model组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.05)；与model组相比，Sev-L、Sev-H组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.05)；与Sev-H组相比，Sev+DKK1组大鼠神经功能评分明显降低(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠神经功能评分和SAH评分Table 1 Neurological function score and SAH score of rats in each group (x±s, n=18)

2.2 各组大鼠的SAH评分

与sham组相比，model组大鼠SAH评分显著升高(P<0.05)；与model组相比，Sev-L、Sev-H组大鼠SAH评分明显降低(P<0.05)；与Sev-H组相比，(Sev+DKK1)组大鼠SAH评分明显升高(P<0.05)(图1，表1)。

2.3 各组大鼠脑组织EB渗出量和脑组织含水量(BWC)

与sham组相比，model组大鼠EB渗出量显著升高(P<0.05)；与model组相比，Sev-L、Sev-H组大鼠EB渗出量明显降低(P<0.05)，BWC有降低的趋势；与Sev-H组相比，Sev+DKK1组大鼠EB渗出量明显升高(P<0.05)，BWC有所增加(表2)。

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group图1 各组大鼠全脑蛛网膜下腔出血情况Fig 1 Whole brain subarachnoid hemorrhage of rats in each group(n=12)

表2 各组大鼠EB渗出量和BWCTable 2 EB exudation and BWC of rats in each group(x±s, n=6)

2.4 各组大鼠皮层神经细胞凋亡

与sham组相比，model组大鼠TUNEL阳性细胞比例明显上升，细胞凋亡率、Bax表达显著升高，Bcl-2表达显著降低(P<0.05)；与model组相比，Sev-L、Sev-H组大鼠TUNEL阳性细胞比例明显下降，细胞凋亡率、Bax明显降低，Bcl-2表达明显升高(P<0.05)；与Sev-H组相比，(Sev+DKK1)组大鼠TUNEL阳性细胞比例明显上升，细胞凋亡率、Bax明显升高，Bcl-2表达明显降低(P<0.05)(图2～3，表3)。

表3 各组大鼠皮层神经细胞凋亡率及Bcl-2、Bax表达Table 3 Apoptosis rate and expression of Bcl-2 and Bax in cortical neurons of rats in each group(x±s, n=6)

2.5 各组大鼠脑组织BBB相关蛋白的表达

与sham组相比，model组大鼠脑组织occludin、ZO-1、claudin-5表达显著降低，MMP-9表达显著升高(P<0.05)；与model组相比，Sev-L、Sev-H组大鼠脑组织occludin、ZO-1、claudin-5表达明显升高，MMP-9表达明显降低(P<0.05)；与Sev-H组相比，Sev+DKK1组大鼠occludin、ZO-1、claudin-5表达明显降低，MMP-9表达明显升高(P<0.05)(图4，表4)。

表4 各组大鼠脑组织BBB相关蛋白的表达Table 4 Expression of BBB related proteins in brain tissue of rats in each group (x±s, n=6)

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group图2 各组大鼠皮层神经细胞凋亡(TUNEL)Fig 2 Cortical neuron apoptosis of rats in each group (TUNEL)(n=12)

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group图3 各组大鼠脑组织Bcl-2、Bax的表达Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax in brain tissue of rats in each group(n=12)

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group图4 各组大鼠脑组织BBB相关蛋白的表达Fig 4 Expression of BBB related protein in brain tissue of rats in each group(n=12)

2.6 各组大鼠脑组织Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路相关蛋白的表达

与sham组相比，model组大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin表达显著降低，p-GSK-3β/GSK-3β比值显著升高(P<0.05)；与model组相比，Sev-L、Sev-H组大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin表达明显升高，p-GSK-3β/GSK-3β表达明显降低(P<0.05)；与Sev-H组相比，Sev+DKK1组大鼠Wnt3a、β-catenin表达明显降低，p-GSK-3β/GSK-3β比值明显升高(P<0.05)(图5，表5)。

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group； E.Sev+DKK1 group图5 各组大鼠脑组织Wnt/GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白的表达Fig 5 Wnt/GSK-3 in brain tissue of rats in each group β/β-expression of catenin pathway related proteins(n=12)

表5 各组大鼠脑组织Wnt/GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白的表达Table 5 Wnt/GSK-3 in brain tissue of rats in each group β/β-expression of catenin pathway related proteins (x±s, n=6)

3 讨论

SAH后的EBI是影响患者预后的关键因素，脑水肿、BBB破坏、神经细胞凋亡等是SAH后EBI的关键部分[10]。Sev是一种新型吸入性麻醉剂，具有诱导快、苏醒快、易于控制、呼吸道刺激小等优点。研究发现，其对不同脑部疾病的大脑具有保护作用，范围从外伤到缺血或缺氧再灌注损伤[4-5]。而且Sev可抑制SAH后神经元凋亡，减轻SAH后的EBI[6]。紧密连接蛋白(ZO-1、occludin和claudin-5)是BBB维持脑微环境动态平衡的关键成分。MMP-9降解多种神经系统疾病中的紧密连接蛋白。本研究结果显示，给予1.5%和3%的Sev干预1 h后，SAH大鼠神经功能明显改善，SAH评分、EB渗出量、神经细胞凋亡率降低，且脑组织occludin、ZO-1、claudin-5、Bcl-2表达升高，MMP-9、Bax表达降低；提示Sev可改善BBB，抑制神经元凋亡，减轻SAH后的EBI。

维持BBB完整性对于调节中枢神经系统稳态至关重要。据报道，Wnt/β-catenin信号在BBB的形成和维持中起着至关重要的作用[8]。Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白家族，目前已发现19种，其中Wnt3a在神经系统中有明显表达，参与了神经分化及发育过程。β-catenin是一种细胞骨架蛋白，是参与调节经典Wnt信号通路的关键信号分子。Wnt/β-catenin未被激活时，β-catenin会被GSK-3β组成的复合物磷酸化而降解；β-catenin的失活诱导了成年脑内皮细胞中的BBB分解和特定紧密连接蛋白claudin-5和-3的下调[11]。本研究发现，SAH大鼠BBB被破坏的同时伴随着脑组织Wnt3a、β-catenin表达降低，p-GSK-3β/GSK-3β比值升高，说明Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路被抑制，进一步检测了脑组织中BBB相关紧密连接蛋白的表达，结果显示，ZO-1、occludin和claudin-5的表达均降低，再次证实β-catenin的失活与BBB的破坏有关。

当Wnt信号通路激活后，Wnt分泌后能通过抑制GSK-3β等蛋白组成的β-catenin降解复合物的降解活性，稳定胞质中的β-catenin蛋白，进入细胞核后参与转录调节。槲皮素可以通过激活Wnt/β-catenin途径，减弱MMP-9激活，保护脑缺血再灌注损伤中的BBB功能障碍，且这些保护作用可被DKK1逆转[12]。Sev可通过激活Wnt/GSK-3β/β-catenin通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[13]。在SAH后小剂量短期给予Sev可能通过稳定β-catenin来减轻早期脑水肿[14]；说明Sev可抑制β-catenin的降解。在本研究中，给予Sev干预后，脑组织Wnt3a、β-catenin表达明显升高，p-GSK-3β/GSK-3β表达明显降低；提示Sev可激活Wnt/β-catenin通路。此外，为了进一步验证Sev对Wnt/β-catenin通路的调控作用，对SAH大鼠应用了Wnt/β-catenin通路的特异性抑制剂DKK1，结果显示，DKK1可明显削弱Sev对SAH后EBI的保护作用，进一步证实该结论；提示，Sev可能通过激活Wnt/β-catenin通路，减轻SAH后的EBI。

综上所述，Sev可能通过激活Wnt/β-catenin通路，改善BBB，抑制神经元凋亡，减轻SAH后的EBI。本研究仅从动物水平进行了初步探究，后续可考虑从体外细胞水平进行深入研究。