miR-486参与OSAHS合并继发性红细胞增多症的发生

石雪峰，孙泽蕊，3，何 响，3，解友邦，顾玉海，多 杰*

(青海省人民医院 1.呼吸与危重症医学科; 2.血液风湿科，青海 西宁 810007; 3.青海大学，青海 西宁 810000)

阻塞性睡眠呼吸暂停/低通气综合征(obstruc-tive sleep apnea/hypoventilation syndrome, OSAHS)是一种常见的疾病，影响大约10%～17%的成年人[1]。OSAHS的特征是睡眠期间反复呼吸暂停导致间歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)、唤醒、夜间低氧血症和胸腔内压力变化，反复的间歇性低氧导致红细胞继发性增多，从而导致继发性红细胞增多症(secondary polycythemia，SP)的发生。

miR-486最早是由人胎肝组织中鉴定的microRNA(miRNA)，除被证明为是一种低氧相关的miRNA[2]， 亦被证实与造血细胞的糖代谢有关[3]。研究显示沉默信息调节因子1(Sirt1)可能参与了OSAHS的发病过程[4-5]，作者既往研究显示miR-486可以通过调控Sirt1调控造血细胞TF-1细胞红系分化过程[6]。加之，继发性红细胞增多症被普遍认为是OSAHS的主要并发症之一，与OSAHS的发展之间存在密切关联[7]。因此，本研究旨在探讨miR-486是否参与了OSAHS相关SP病理过程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及病例:红白血病细胞K562细胞由青海省人民医院血液研究室保存。选取2020年5月至2021年4月在青海省人民医院门诊及健康体检中心就诊的汉族健康体检者25名作为对照组，于该院就诊的OSAHS合并继发性红细胞增多症的30例患者作为(OSAHS+SP)组。纳入(OSAHS+SP)组患者符合2017美国睡眠学会《成人阻塞性睡眠呼吸暂停诊断临床指南》诊断标准[8]。且符合红细胞增多症诊断标准[9]。所有受试者均签署患者知情同意书后入组，且排除其他呼吸系统疾病，真性红细胞增多症等疾病。一般情况见表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of all primer

1.1.2 试剂(盒)：RPMI-1640培养液(Gibco公司)， 胎牛血清(Applied Stem Cell公司)， 兔抗人Sirt1抗体(Abcam公司)， 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 二抗(北京中衫金桥公司)， Trizol(Invitrogen 公司)，miR-486引物、反转录及qRT-PCR检测试剂盒(ABI公司)， RPMI-1640培养基(Gibco 公司)， 胎牛血清(Applied Stem Cell公司)，Sirt1ELISA 试剂盒(上海西唐实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将K562分为：1)间歇性低氧： 一个间歇性低氧循环为2% O284 s，19% O25 min，共进行60个循环。2)miR-486沉默或过表达K562细胞及Sirt1沉默细胞，均采用慢病毒技术进行沉默或过表达。

1.2.2 血浆收集及外周血单个核细胞提取：取清晨空腹静脉血5 mL，3 500 r/min 离心15 min 后收集血浆于-80 ℃储存。取清晨空腹静脉血5 mL，用等体积的PBS稀释并混匀，贴壁加入盛有外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心后取上层与中层之间的单个核细胞层至新的离心管，PBS洗2～3次后-80 ℃备用。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-486、Sirt1、GATA-1及GATA-2的表达：分别用Trizol裂解单个核细胞、IH及慢病毒处理的K562细胞，按步骤加入三氯甲烷及异丙醇提RNA。以β-actin为内参，用SYBR法检测miR-486、Sirt1、 GATA-1及 GATA-2的表达。以U6为内参,用Taqman microRNA 反转录试剂盒说明书及特定引物进行miRNA的反转录及RT-qPCR测定，循环数为40个，以 2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.2.4 ELISA检测血浆Sirt1浓度:实验步骤按照试剂盒操作步骤进行。

1.2.5 Western blot 检测Sirt1表达:K562细胞经慢病毒过表达或沉默miR-486后提取蛋白，进行蛋白定量后以20 μg上样，进行跑胶、转膜、封闭及加稀释一抗(Sirt1/GAPDH)4 ℃慢摇过夜，次日洗膜3次后加二抗室温慢摇1 h，再次洗膜3次后加发光液检测蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

实验数据用平均值±标准差(x±s)表示;采用SPSS 19.0软件统计数据并分析，两组数据统计分析采用独立样本t检验；相关性分析采用Pearson。

2 结果

2.1 入组病例一般资料对比

OSAHS合并SP患者体质指数(body mass index，BMI)、睡眠呼吸暂停指数(apnea hypopnea index，AHI)、红细胞及血红蛋白相对于对照组明显升高(P<0.001)(表2)。

表2 对照组及OSAHS+SP患者一般资料对比Table 2 Characteristics of control group and the OSAHS combined with secondary polycythemia group

2.2 对照组及OSAHS+SP单个核细胞miR-486、Sirt1、GATA-1 mRNA表达水平及血浆Sirt1浓度

与对照组相比，OSAHS+SP患者血浆miR-486表达升高，Sirt1表达mRNA水平及蛋白水平均降低，GATA-1表达亦降低(P<0.001)。然而，在两组外周血单个核细胞中均未检测到GATA-2表达(表3)。

表3 外周血单个核细胞miR-486、Sirt1、GATA-1及血浆Sirt1浓度Table 3 Expression of miR-486, Sirt1, GATA-1 in PBMC and plasma Sirt1 concentraion

2.3 OSAHS+SP患者相关性分析

OSAHS+SP患者单个核细胞miR-486、Sirt1、GATA-1 mRNA表达水平及血浆Sirt1浓度与AHI、HB均具有相关性。其中单个核miR-486、GATA-1均与AHI及HB呈正相关(P<0.05)。而单个核细胞Sirt1mRNA表达、血浆Sirt1表达水平与AHI及HB均呈负相关(P<0.05)(表4)。

表4 外周血单个核细胞miR-486、Sirt1、GATA-1及血浆Sirt1表达与AHI和Hb的相关性Table 4 Correlation of PBMC miR-486, Sirt1, GATA-1 expression and plasma concentration with AHI and Hb

2.4 miR-486通过下调Sirt1调控OSHAS相关继发性红细胞增多症的发生

IH可以促进K562细胞miR-486的表达(左)，而抑制Sirt1表达(右)。K562细胞过表达miR-486可以同时从RNA及蛋白水平抑制Sirt1的表达，而沉默miR-486后Sirt1在RNA水平及蛋白水平均表达升高。沉默Sirt1后GATA-1的表达升高(图1)。

3 讨论

间歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)是OSAHS的基本特征，主要由于呼吸道阻塞所致，表现为睡眠障碍和间断缺氧。OSAHS患者除白天嗜睡外,严重者还可表现为红细胞增多、血小板活化及血栓性疾病。

A.expression of miR-486 and Sirt1 in K562 cells after IH treatment； B.Sirt1 expression after miR-486 over-expression or inhibition-RT-qPCR； C.expression of GATA-1 after Sirt1 inhibition； D.Sirt1 expression after miR-486 over-expression or inhibition-Western blot; *P<0.05 compared with control图1 miR-486通过下调Sirt1调控GATA-1表达Fig 1 miR-486 down-regulated Sirt1 expression and up-regulated GATA-1 expression

GATA-1是GATA家族的创始成员，可正向调控红系细胞发育，GATA-2主要维持和促进早期造血组细胞的分化过程。研究亦显示先天性GATA-1突变与先天性红系发育不全相关[10]。GATA-1可激活血红素合成，GATA1和血红素一起介导红细胞的成熟[11]。因此， GATA-1与造血细胞红系分化密切相关。本研究显示OSAHS合并继发性红细胞增多症患者外周血单个核细胞GATA-1表达明显升高，而未检测到GATA-2的表达，提示GATA-2在外周血单个核细胞中不存在表达或表达量极低。因此，研究推测GATA-1可能同样参与了OSAHS相关继发性红细胞增多症的发病过程。

表观遗传调控在OSAHS的各种不良反应的发生机制中发挥了重要作用[12]。miR-486是首先于胎肝中发现的miRNA，参与了造血红系分化过程。研究表明miR-486参与了红细胞生成调控过程[13]。作者既往研究亦显示在TF-1细胞中miR-486可能通过调控其靶基因Sirt1调控造血细胞红系分化[3]。本研究显示OSAHS合并SP患者外周血单个核细胞miR-486的表达是升高的，而单个核细胞Sirt1表达及血浆Sirt1浓度均是降低的。相关性分析显示OSAHS合并SP患者单个核细胞miR-486、Sirt1、GATA-1、血浆Sirt1均与患者AHI及HB具有显著相关性。因此，本研究推测miR-486可能通过调控Sirt1表达调控GATA-1的表达参与了OSAHS相关继发性红细胞增多症的发病过程。并且，外周血单个核细胞miR-486、Sirt1及GATA-1表达水平及血浆Sirt1浓度可能是OSAHS合并继发性红细胞增多症疾病严重程度的辅助评估指标。

间歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)是OSAHS的基本特征，为进一步明确miR-486在OSAHS合并继发性红细胞增多症发病中的调控机制，将K562细胞进行IH处理后检测miR-486等的表达，结果显示IH可以促进K562细胞miR-486的表达，抑制Sirt1的表达。应用慢病毒技术将K562细胞过表达miR-486后Sirt1表达降低，而沉默miR-486后Sirt1表达升高，进一步明确了Sirt1为miR-486的靶基因。同时，研究结果显示沉默Sirt1后GATA-1表达升高。提示IH可能通过上调miR-486的表达从而下调Sirt1的表达参与OSAHS相关SP的发生。

应用TransmiR v2.0数据库对转录因子GATA-1调控的miRNA进行预测，结果显示GATA-1可能通过多个结合位点作用于miR-486, 在血液中起到调控miR-486表达的作用。因此本研究推测miR-486通过靶向Sirt1上调GATA-1的表达，而作为转录因子的GATA-1可以通过多位点与miR-486结合上调miR-486表达，从而导致疾病的恶性循环过程。

因此，本研究认为miR-486、Sirt1及GATA-1可能参与了OSAHS相关SP的病理过程，其中miR-486和GATA-1起正调控作用，Sirt1起负调控作用。并且研究显示间歇性低氧通过上调miR-486的表达，下调Sirt1的表达，进而上调GATA-1的表达参与了OSAHS相关SP的发生。