一株藻际芽孢杆菌对条斑紫菜生长及生理的影响

欧阳乐飞，王林华，段健诚，张庆起,高 焕,阎斌伦

(1.江苏海洋大学 江苏省海洋生物技术重点实验室 江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室，连云港 222005；2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，连云港 222005；3.连云港赣榆佳信水产开发有限公司，连云港 222100；4.江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014)

藻类与藻际微生物的相互关系复杂，二者相互利用或相互拮抗，通过相互作用进行选择[1]。藻类在生长过程中向外释放有机物吸引微生物共附生，使藻体周围形成具有独特结构与功能的微生物群落，这种独特的微环境称为“藻际微环境”(phccosphere)[2]。藻类不断向周围环境释放氨基酸与其他代谢产物，为共生、附生的藻际微生物提供营养[3]。藻体表面适合微生物共附生，能够为微生物提供适宜的蔽护[4]，并利用微环境特性筛选藻际微生物，微生物既是生产者，也是分解者，主要通过代谢参与藻际微环境中物质的分解与转化，通过分泌大量有机物，影响藻类的生长[5]。

条斑紫菜(Pyropiayezoensis)是我国北方地区产量最高的紫菜栽培种，具有较高的药用、营养及生态价值。近年来，紫菜养殖海区环境恶化，病害频发，且紫菜病害过程复杂，在紫菜丝状体时，河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)易引发黄斑病[6]，茎点菌(Phomaporphyrae)导致白斑病[7]；由紫菜腐霉导致赤腐病[8]等。此外，紫菜致病因素还与紫菜本身健康状况和自然环境条件相关。光照太弱，通风不良会导致紫菜丝状体泥红病[9]；光照太强会引起紫菜叶状体绿斑病[10]；缺乏氮引起丝状体绿斑病[11]，这表明环境变化会改变微生物的功能与组成，进而影响藻类生长与生理状态[12]。芽孢杆菌具有产芽孢、快速繁殖、高耐受性等特点，能够增强藻类生长、改善水体微生态环境，被认为是最有应用前景的抗生素替代品之一[13]。因此，藻际微环境与藻类之间的生态关系成为近年研究焦点，但是关于藻际附生菌与紫菜间的相互影响机制研究鲜有报道。通过研究藻际附生菌——芽孢杆菌(Bacillussp.LPyS1)对条斑紫菜生长及生理的影响，以期为条斑紫菜健康养殖提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 条斑紫菜叶状体

条斑紫菜叶状体采集于连云港市连云区西墅条斑紫菜养殖海区，洗净阴干后，密封保存于-20℃冰箱。实验前取出样品，在灭菌海水中复苏1 d，挑选形状一致的红褐色叶片，裁成1 cm2小块，用灭菌海水清洗3次以上、于0.7% 碘化钾(KI)溶液浸泡10 min后，再用灭菌海水清洗干净。条斑紫菜复苏培养后，对叶片进行无菌处理，处理方法参考文献[14]。将叶片浸泡于质量分数为0.1%的氨苄青霉素溶液中10 min，后转移至组合抗生素(300 μg/mL氨苄青霉素、100 μg/mL卡那霉素、100 μg/mL庆大霉素)中处理10 h以上，经灭菌海水漂洗3次后放入紫菜培养基(营养母液：100 g/L KNO3、10 g/L KH2PO4、2.5 g/L FeSO4、0.25 g/L MnSO4和20 g/L EDTA-Na2，用0.22 μm滤膜过滤，使用时与灭菌海水以1∶1 000配制成营养海水)。培养2 d备用，培养条件：温度12 ℃，盐度30，光强3 500 lx，光周期12 L∶12 D，每24 h更换1次培养基，在充气条件下培养。

1.1.2 芽孢杆菌

Bacillussp.LPyS1由本实验室分离自条斑紫菜叶状体表面，加甘油后于-80 ℃冻存。37 ℃ 140 r/min培养24 h活化(Zobell 2216E海水培养基：酵母粉1 g，蛋白胨5 g，柠檬酸铁0.1 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.6～8.0)。扩大培养与活化培养条件一致，24 h后离心去除培养液。沉淀清洗离心后，用条斑紫菜培养液调整细胞浓度约1×106cells/mL备用。并对芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1最适生长温度进行测定：在试管中加入10 mL Zobell 2216E海水培养基，灭菌冷却后将芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1按1%接种量接种于液体培养基试管中，分别置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃这7个温度梯度下，160 r/min摇床培养24 h，以不接种Zobell 2216E海水培养基作为对照，每个处理3个重复，测定OD600，以确定其生长的最适温度。

1.2 方法

向300 mL紫菜培养基中接种0.2 g无菌处理过的条斑紫菜叶状体与3×106cells/mLBacillussp.LPyS1，在温度12 ℃，盐度30，光强3 500 lx，光周期12 L∶12 D,充气条件下培养。在培养后的0、6、12、24、48和72 h取样，测定其相对生长率(RGR)、总蛋白(Total protein)、叶绿素a(Chla)、藻胆蛋白(RPE、RPC、APC)、游离脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)的含量，以及超氧化物岐化酶活性(SOD)与过氧化物酶(POD)活性。以经无菌处理的条斑紫菜叶状体培养作为对照，培养条件与共培养组相同，每组实验设3个平行。

按照公式计算相对生长率(RGR)[15]：RGR(%/d)=(lnMt-lnM0)/t×100，式中，M0为藻体的初始质量，g；Mt为培养至第t天藻体的鲜重，g，称量前将藻体表面培养液吸干。酶活测定采用南京建成生物科技公司T-SOD试剂盒(A001-1，羟胺法)和POD测定试剂盒(A084-3，比色法)；采用南京建成生物科技公司试剂盒(A003-3-1，微板法)测定MDA含量；采用考马斯亮蓝法[16]测定可溶性蛋白含量；采用南京建成生物科技公司试剂盒(A107-1-1，酸性茚三酮法)测定Pro含量；参考陈新美等[17]的方法测定藻胆蛋白含量。实验中对每个样本均进行4次重复测定分析。

1.3 数据统计分析

实验数据采用Origin 2018和SPSS 25.0统计软件进行数据处理及统计分析，以P<0.05表示显著性差异，P<0.01表示极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌最适生长温度的测定

由图1可知，芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1随着培养温度的逐步升高OD600也逐步升高，培养温度到35 ℃时OD600最大。在10 ℃～35 ℃时，随着培养温度的增加OD600呈上升趋势，在35 ℃～40 ℃时OD600呈迅速下降的趋势。芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1的最适生长温度为35 ℃。

图1 不同温度对芽孢杆菌Bacillus sp.LPyS1的影响Figure 1 Effects of different temperatures on Bacillus sp.LPyS1

2.2 芽孢杆菌对条斑紫菜生长的影响

条斑紫菜培养至第4天，对照组叶片开始变白，出现空泡，边缘呈不规则状态，表明在无菌培养条件下，条斑紫菜的生长受到不利影响。而共培养组中，细菌多聚集在条斑紫菜的叶片的边缘区域，颜色无明显变化。图2显示，从开始至培养48 h期间，共培养组条斑紫菜的RGR一直处于上升状态，至48 h达到最大(4.8%/d)，且显著高于对照组(P<0.05)，之后开始缓慢下降但仍高于对照组。

*表示同一时间点不同处理组之间差异显著(P<0.05)。Treat表示藻-菌共培养组；Control表示对照组。图2 Bacillus sp.LPyS1对条斑紫菜相对生长率的影响Figure 2 Effects of Bacillus sp.LPyS1 on relative growth rate (RGR) of P. yezoensis

2.3 芽孢杆菌对条斑紫菜抗氧化性的影响

由图3(a)可知，随着培养时间的延长，共培养组SOD一直处于下降趋势，而对照组在0～24 h先下降后上升至最大值(14.3 U/mg)，之后一直下降，与对照组相比，共培养组在6 h显著高于对照组(P<0.05)，但在24 h显著低于对照组(P<0.05)。由图3(b)可知，共培养组与对照组的POD活性波动相似，呈先下降后上升的循环趋势，两组条斑紫菜POD活性分别在12 h和48 h达到最大值，分别为9.2 U/mg与8.9 U/mg，对照组POD活性在6 h最低，为3.3 U/mg，而共培养POD活性则在24 h最低，为3.8 U/mg，只有在6 h共培养组POD活性显著高于对照组(P<0.05)。由图3(c)可知，共培养组与对照组MDA含量在6～48 h呈上升趋势，但在48～72 h下降，两组MDA含量均在48 h达到最大，其中共培养组为137.91 nmol/mg，对照组为226.33 nmol/mg，两组间具有极显著性差异(P<0.01)。

*表示同一时间点不同处理组之间差异显著(P <0.05)。Treat表示藻-菌共培养组；Control表示对照组。图3 Bacillus sp.LPyS1对条斑紫菜抗氧化性的影响Figure 3 Effect of Bacillus sp.LPyS1 on the antioxidant indexes of P. yezoensis

2.4 芽孢杆菌对条斑紫菜渗透性的影响

由图4(a)可知，共培养组总蛋白含量总体呈上升趋势，而对照组在0～48 h先上升后下降，两组总蛋白含量在12、48和72 h均有显著性差异(P<0.05)，其中在12 h共培养组显著低于对照组(P<0.05)，而48 h与72 h共培养组显著高于对照组(P<0.05)。由图4(b)可知，两组Pro含量变化趋势相似，在0～12 h与24～72 h期间均为上升，其中对照组在12 h的Pro含量陡然上升，达到最大(31.14 ug/g)，极显著高于共培养组(P<0.01)；与对照组相比，共培养组Pro含量组间变化幅度较小。

*表示同一时间点不同处理组之间差异显著(P <0.05)。Treat表示藻-菌共培养组；Control表示对照组。图4 Bacillus sp.LPyS1对条斑紫菜渗透性的影响Figure 4 Effect of Bacillus sp.LPyS1 on the penetration index P. yezoensis

由图5(a)可知，两组叶绿素a均在0～48 h上升，至48 h达到最大，其中共培养组为9.72 mg/L，对照组为8.24 mg/L，且在12 h与48 h共培养组叶绿素a含量显著高于对照组(P<0.05)。如图5(b)～5(d)所示，藻胆蛋白含量变化总体上相似，共培养组均呈先上升后下降的趋势，对照组则呈先下降后上升的趋势。除0 h外，共培养组含量均高于对照组，且在6 h和48 h差异显著(P<0.05)。两组藻胆蛋白含量均在48 h达到最大，其中对照组R-藻红蛋白(phycoerythrin,RPE)为4.16 mg/g,R-藻蓝蛋白(phycocyanin,RPC)为2.02 mg/g，别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)为1.19 mg/g；共培养组RPE为6.82 mg/g，RPC为3.46 mg/g，APC为2.69 mg/g。

*表示同一时间点不同处理组之间差异显著(P <0.05)。Treat表示藻-菌共培养组；Control表示对照组。图5 Bacillus sp.LPyS1对条斑紫菜色素的影响Figure 5 Effect of Bacillus sp.LPyS1 on pigment of P. yezoensis

3 讨论与结论

3.1 芽孢杆菌对条斑紫菜生长的影响

藻类和藻际微生物两者处于动态平衡状态，当自然环境发生剧变时，二者之间的相互关系被破坏，造成藻际微生物群落结构失衡，导致各种藻类病害暴发[18]。研究表明，芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1有利于促进条斑紫菜生长与总蛋白的积累，与对照组相比，前期共培养组RGR显著上升(P<0.05)，两者关系为互利共生，说明良好的藻际环境能够促进微生物与藻类之间的生态平衡，这与周进等[19]在藻-菌相互作用关系的研究一致。培养至72 h后，芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1对条斑紫菜RGR影响不显著(P>0.05)，这与熊玉琴等[20]研究藻际微生物对坛紫菜生长的结果一致，由图1可知该温度不适合芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1的生长，导致其活力逐渐下降。

藻类分泌的胞外产物，一部分可以被异养微生物生长繁殖利用，此类微生物可将大分子的有机物质分解为小分子物质或微量元素再次被藻类利用[21-22]。研究表明，在光合作用下，藻类所产生的溶解氧会增强其光呼吸作用，不利于藻类的生长，而异养细菌的生长与繁殖会消耗大量溶解氧并释放CO2，使周围形成一种还原性的藻际微环境，从而促进藻类的生长[23-24]。Hughes等[25]研究发现玫瑰杆菌(Roseobacter)与颗石藻(Coccolithophore)共培养时会产生新物质——玫瑰毒素，该物质抑制了颗石藻的生长。本实验结果提示芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1对条斑紫菜生长具有促进作用，条斑紫菜前期的RGR快速上升可能是利用了芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1分解的小分子物质，如维生素、矿物质等。

3.2 芽孢杆菌对条斑紫菜生理的影响

植物体内SOD与POD活性提高表明植物对多种抗氧化胁迫的抗性得到提高，当植物受到严重胁迫时尤为明显[26]。在12 ℃培养条件下，共培养组SOD一直下降说明芽孢杆菌对条斑紫菜的胁迫作用很小，而对照组上升后下降表明无菌状态不利于条斑紫菜生长，但是条斑紫菜自身的抗逆性使得其受到的氧化胁迫减小，导致在6 h与24 h共培养组与对照组具有显著性差异(P<0.05)。POD呈先下降后上升的循环趋势表明藻菌共培养初期芽孢杆菌对条斑紫菜的促进作用较大，而随着培养时间的延长芽孢杆菌逐渐弱化，其作用下降造成条斑紫菜氧化胁迫上升，致使48 h共培养组与对照组两者POD活性较高，最终在72 h两组条斑紫菜均由于自身保护机制促使酶活下降。而衡量细胞膜脂损伤程度的指标MDA，与对照组相比，共培养组含量在48 h出现了极显著差异(P<0.01)，含量为226.33 nmol/mg，高于张元等[27]测定的野生型坛紫菜MDA含量，这表明无菌处理不利于条斑紫菜生长。

藻菌共培养组总蛋白含量总体呈上升趋势说明芽孢杆菌有利于条斑紫菜蛋白的合成，而前期对照组总蛋白含量先上升后下降表明无菌处理短期内对条斑紫菜的影响不显著，培养48 h后对条斑紫菜蛋白的合成造成的抑制作用，导致48 h与72 h共培养组总蛋白含量显著高于对照组。非酶促系统Pro含量可判断逆境环境对藻类的危害程度以及藻类对逆境的抵抗能力[28]。本研究共培养组12 h时Pro含量显著低于对照组(P<0.05)。当藻类生物膜被破坏，藻细胞内Pro含量会随之上升[29]，但是随着培养时间的延长，条斑紫菜Pro含量会因为细胞内SOD下降而下降，表明Pro具有清除自由基，从而避免细胞被损伤的作用。

芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1对条斑紫菜光和色素合成具有显著影响(P<0.05)，其中在12 h与48 h共培养组显著高于对照组(P<0.05)，主要包括藻胆蛋白和叶绿素Chla。藻胆蛋白具有储存氮源的功能，同时丰富的氮源有利于促进藻胆蛋白合成，反之，当缺乏氮源时，藻胆蛋白的合成会显著下降或停止[30]。本实验研究表明芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1有利于条斑紫菜所需氮源的合成，这与Amin等[31]的研究结果一致。Ben等[32]通过筛选几种氮源促进芽孢杆菌Bacillussp.R2快速繁殖，间接证实了氮源有利于条斑紫菜生长及藻胆蛋白的累积。由此推测藻际芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1有可能通过产生生长调节物质，促进氮源合成从而影响条斑紫菜的生长，这有待进一步研究。

条斑紫菜的病害防治、藻-菌间相互作用机制已经成为热门研究之一，通过研究芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1对条斑紫菜生长和生理的影响，更好地指导条斑紫菜的病害防治与健康养殖。本研究表明，短期内芽孢杆菌Bacillussp.LPyS1能促进条斑紫菜生长与光合作用，藻际附生菌Bacillussp.LPyS1可以为条斑紫菜提供生长所需的营养物质以促进其健康生长，同时也为稳定藻际微环境提供必要的条件。