基于硫巯基化的硫化氢信号分子作用新途径

李小二，陈宏艳，李忠光

(云南师范大学 生命科学学院 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,昆明 650500)

18世纪发现的硫化氢(hydrogen sulfide,H2S) 长期以来被认为是一种有毒的气体分子[1]。在二叠纪末期，由于火山爆发及海洋中厌氧绿色硫细菌的大量繁殖，向地球释放H2S，可能是导致95%的海洋生物和70%陆生生物灭绝的主要原因之一[2]。此外，由于H2S对含有亚铁离子的蛋白质如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶(catalase,CAT)等有很高的亲和力，抑制它们的活性，故可导致细胞代谢的紊乱，甚至细胞死亡[3]。在植物中，H2S的毒性还表现在抑制根系对磷的吸收、光合作用中氧的释放和植物生长，以及促进叶片的损伤与脱落[4]。

而今，人们发现H2S可在植物体内合成并发挥诸多生理效应[5]，已被公认是一种新的信号分子[6]。因此，H2S在植物中的研究热点，已从毒害效应转向信号分子。研究表明，H2S参与种子萌发、幼苗建成、植物生长、生殖和响应逆境胁迫[3,6]。H2S作为信号分子，可独立地或与其他信号分子如钙离子(calcium ion,Ca2+)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)和植物激素的交互作用，调节许多植物生理过程[7-10]。此外，H2S可触发一种新的翻译后修饰蛋白质硫巯基化(protein S-sulfhydration)，也称过硫化(persulfidation)或硫化作用(sulfuration)。蛋白质硫巯基化是H2S作为信号分子，是发挥其生理功能的主要作用方式[11]。

H2S可硫巯基化自身的及信号分子ROS、NO、糖和植物激素的代谢和信号转导的关键酶(包括蛋白)[12]，继而成为H2S与这些信号分子交互作用的主要途径。目前，植物中关于H2S信号的综述，主要侧重于其理化性质、合成与分解代谢，以及其在植物生长发育与响应逆境胁迫中的作用[1-4,6]，而阐明H2S通过蛋白质硫巯基化修饰与其他信号分子交互作用的综述鲜有报道。因此，本文综述了基于H2S触发的信号分子的代谢酶和信号蛋白的硫巯基化的最新研究进展，归纳了H2S通过硫巯基化的自我放大，以及与ROS、NO、糖和植物激素的交互作用。目的是提出H2S通过硫巯基化与ROS、NO、糖和植物激素信号的交互作用的关键点。

1 植物中蛋白质硫巯基化修饰

蛋白质(包括酶)的巯基(sulfhydryl group,-SH)可被H2S修饰，产生硫巯基化的蛋白(P-SSH)，此过程称为蛋白质硫巯基化修饰[11-12]。此外蛋白质巯基也可被ROS(主要是H2O2)氧化，产生次磺酸(sulfenic aicd,-SOH)、亚磺酸(sulfinic acid,-SO2H)或磺酸(sulfonic acid,-SO3H)，分别称为次磺酰化、亚磺酰化和磺酰化修饰[13](图 1)。蛋白质巯基也可被NO氧化，形成亚硝基化的蛋白(-SNO)，此过程称为亚硝基化作用(nitrosylation)或亚硝化作用(nitrosation)，也是一种翻译后修饰[14]。同时，蛋白质巯基也可被谷胱甘肽(glutathione,GSH)修饰，产生谷胱甘肽化的蛋白(-SSG)。此过程称为蛋白质的谷胱甘肽化(glutathionylation)[12]。谷胱甘肽化的蛋白可被H2S转变为巯基化的蛋白[11]。硫巯基化的蛋白也可被ROS进一步氧化，形成过硫次磺酸(perthiosulfenic acid,-SSOH)、过硫亚磺酸(perthiosulfinic acid,-SSO2H)或过硫磺酸(perthiosulfonic acid,-SSO3H)[12]。

次磺酰化(-SOH)和亚硝基化(-SNO)的蛋白可进一步被H2S修饰，还原为硫巯基化的蛋白 (-SSH)[12]。此外，次磺酰化(-SOH)的蛋白也可与另一蛋白的巯基反应，产生蛋白间二硫键(disulfide bond,-S-S-)[14](图1)。在这些翻译后修饰中，过硫次磺酸(-SSOH)、过硫亚磺酸(-SSO2H)、过硫磺酸(-SSO3H)和二硫键(-S-S-)可被硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)还原为巯基(SH)[14]。然而，被ROS氧化产生的次磺酸(-SO2H)和亚磺酸(-SO3H)不能被其他还原剂或酶还原为巯基。为了避免造成细胞代谢紊乱，这些氧化的蛋白可通过蛋白酶体降解[15]。此外，被ROS氧化产生的次磺酸(-SO2H)和亚磺酸(-SO3H)可导致蛋白构象和活性的改变，蛋白质硫巯基化修饰可能对含有巯基的蛋白(包括酶)起保护作用，避免被ROS的氧化和维持细胞氧化还原平衡。

图1 植物中硫巯基化修饰与其他翻译后修饰的交互作用Figure 1 Interaction between S-sulfhydration and other posttranslational modifications in plants

与H2S相比，硫烷硫(sulfane sulfur,SS)如二硫化氢(hydrodisulfides,H2S2)、聚硫化物(polysulfides,R-Sn-R)、聚硫化氢(hydrogen polysulfides,H2Sn)和无机过硫化物硫代硫酸盐等，更易触发蛋白质硫巯基化修饰[16]。SS属于活性硫(reactive sulfur species,RSS)，它可能既是H2S的前体，也是H2S的代谢产物。SS作为信号分子，调节植物的生长、发育和响应逆境[17]。在拟南芥中，在不同的生长发育时期，内源SS的水平也不一样，SS水平的高低与植物生长速率呈正相关[18]。这也从一个侧面暗示SS作为信号分子促进植物的生长发育。

H2S、ROS、NO和GSH所引发的翻译后修饰，对靶蛋白产生不同的效应，有的蛋白被活化，称为正效应；有的蛋白被钝化，称为负效应；有的蛋白没有显著影响，称为零效应[11,14]。

2 植物中基于硫巯基化的H2S与其他信号分子的交互作用

如上所述，H2S作为一种新的信号分子，能通过不同信号途径与Ca2+、H2O2、NO、MG和植物激素发生交互作用，继而调节植物的耐逆性如耐热性、耐冷性、耐盐性、耐旱性、耐涝性和重金属胁迫耐性[9-10,19-20]。有研究从药理学、分子生物学和生理生化等方面，阐明了H2S与上述信号分子的交互作用[3,6,21]，这里不再赘述。此部分内容主要讨论H2S信号通过对其代谢酶的硫巯基化修饰的自我放大，以及H2S通过硫巯基化修饰与ROS、NO、糖和植物激素等信号的交互作用(图2)。

+和-分别表示促进和抑制;↑和↓分别表示激活和钝化。图2 植物中基于硫巯基化的硫化氢信号的自我放大及硫化氢与活性氧、一氧化氮、糖和植物激素信号的交互作用Figure 2 S-sulfhydration-based hydrogen sulfide (H2S) signaling self-amplificationand interaction between H2S and reactive oxygen species,nitric oxide,sugar,plant hormone in plants

2.1 H2S信号的自我放大

植物中H2S可通过酶促途径和非酶促途径产生，而前者是保持植物细胞中H2S稳态的主要的、可控的途径[3,10]。在酶促途径中，定位于不同亚细胞结构中的L-半胱氨酸脱巯基酶(L-cysteine desulfhydrase,LCD)、D-半胱氨酸脱巯基酶(D-cysteine desulfhydrase,DCD)、半胱氨酸脱巯基酶1(cysteine desulfhydrase1,DES1)、O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(O-acetylserine (thiol) lyase,OASTL)、固氮酶铁硫簇(nitrogenase Fe-S cluster,NFS)、β-氰丙酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,CAS)、半胱氨酸合成酶(cysteine synthetase,CYS)和碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)是H2S合成的关键酶。它们分别以半胱氨酸(cysteine,Cys)或硫化碳(carbonyl sulfide,COS)为底物，合成H2S[6]。通常，H2S产生酶的活性，特别是DES1，可通过转录、转录后加工、翻译和翻译后修饰等方式来调控。如上所述，蛋白质硫巯基化是一种新发现的、重要的翻译后修饰，它可通过对修饰活性位点的半胱氨酸巯基，调节靶蛋白的构象、活性、稳定性和亚细胞定位，继而调节细胞代谢[10]。此外，SS可能是H2S的前体，当还原剂存在时，可释放H2S[17]。在老鼠大脑中，在还原剂硫辛酸存在下，3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MST)的催化下，SS可释放H2S[22]。在拟南芥中，硫巯基化的MST也可用GSH作为还原剂，产生H2S[18]。除了酶促途径外，植物细胞也可通过脱硫作用、含硫化合物途径、葡萄糖途径等非酶促途径产生H2S[2]。

H2S产生酶DES1可被H2S硫巯基化修饰，继而激活它的活性，产生更多的H2S，从而实现H2S信号的自我放大，或称为H2S诱导的H2S爆发(H2S-induced H2S burst)[11,23-24](图2)，类似于Ca2+诱导的Ca2+爆发[25]。例如，在拟南芥保卫细胞中，DES1是H2S产生的关键酶，植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)能通过激活DES1而诱导H2S的积累，继而触发DES1活性位点Cys44和Cys205巯基的硫巯基化，进一步激活该酶的活性，产生更多的内源H2S，最终通过ROS信号途径导致气孔关闭[24]。最近，Moseler等[26]发现，MST也可被3-巯基丙酮酸(3-mercaptopyruvate,MP)硫巯基化，继而调节它的活性和H2S的产生。此外，运用蛋白组学和免疫化学手段也初步发现，拟南芥中的H2S产生酶LCD、DCD、OASTL、NFS、CA、CAS和CYS也可被H2S硫巯基化修饰[11,23]，但具体的机制尚未清楚。

2.2 与ROS信号的交互作用

ROS类似于Ca2+、NO、H2S和MG，具有细胞毒害剂和信号分子的双重作用[27]。在植物中，ROS也可通过酶促途径和非酶促途径[如米勒反应(Mehler reaction)、光合电子传递、呼吸电子传递等]产生[27]。细胞中ROS的稳态可通过精密地调控它们的产生和清除来实现。ROS产生的关键酶NDAPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)可产生超氧阴离子自由基，继而通过超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的催化作用或歧化作用(dismutation)转变为H2O2。因此，NOX在植物细胞ROS平衡和ROS信号引发中起着积极的作用。ROS清除酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和过氧化物酶(peroxidase,POD)也在细胞ROS稳态中扮演重要角色[27]。在拟南芥植物中，NOX活性位点的Cys825和Cys890上的巯基可被H2S硫巯基化修饰，继而提高该酶的活性，促进ROS的合成，最终导致气孔关闭[24]。

CAT活性位点Cys234上的巯基也可被H2S硫巯基化修饰，继而抑制该酶的活性，导致H2O2的积累而引发H2O2信号[28]。相反，APX活性位点Cys168和POD活性位点半Cys46和Cys61上的巯基，也可被H2S硫巯基化修饰，提高它们的活性，最终削弱内源H2O2和H2O2信号[11](图2)。这些结果表明，ROS信号可被H2S通过对NOX、APX、POD和CAT的硫巯基化作用而调控，也就是说ROS信号可被H2S放大或削弱。

2.3 与NO信号的交互作用

NO也可通过酶促和非酶促途径(光合电子传递和呼吸电子传递中亚硝酸盐还原为NO)在植物细胞中合成[29]。在酶促途径中，硝酸还原酶(nitrate reductase,NR；也是氮代谢的关键酶)、NO合成酶(NO synthetase,NOS；在藻类中已发现其基因，但在高等植物中没有发现)和NOS类似蛋白(NOS-like)是NO合成的关键酶[30]。Zhou等[31]报道在水稻中超表达LCD可提高LCD活性，产生更多的内源H2S，继而导致NR的硫巯基化和活性抑制，最终通过调控氮代谢而提高植物的耐旱性。此外，这些生理效应也可被外源H2S处理所诱发[31]。因为NR也是NO合成的关键酶，所以这个结果也从另一个方面暗示H2S对NO信号的调控。然而，H2S对NR的硫巯基化位点需要进一步阐明。ROS代谢酶NOX、CAT和APX除了可被H2S硫巯基化修饰外，它们也可被NO进行亚硝基化修饰[11,14]。亚硝基化抑制了NOX、CAT和APX的活性，暗示了NO和ROS (主要是H2O2)信号的交互作用[14]。同时，亚硝基化的NOX、CAT和APX可被H2S转化为硫巯基化的蛋白，继而增加NOX和APX的活性，抑制CAT活性[32]。这些研究也说明，H2S和NO信号通过蛋白质硫巯基化作用而进行交互作用，或者说蛋白质硫巯基化作用是H2S-NO交互作用的关键点。

2.4 与糖信号的交互作用

糖(主要是葡萄糖和蔗糖)不仅是碳源、能源和多糖的构建模块，也是植物信号分子。糖代谢是细胞代谢的枢纽，在种子萌发、出苗、植物生长、发育和响应逆境中起着关键作用[33]。糖代谢主要包括糖酵解[glycolysis，也称EMP途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)]、三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)和卡尔文循环(Calvin-Benson cycle)。在EMP-TCA途径中，甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPC)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、NADP-苹果酸酶(NADP-malic enzyme,ME)、NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-isocitrate dehydrogenase,ICDH)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)是限速酶。在卡尔文循环中，1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)是光合作用将二氧化碳转变为糖的关键酶[33]。

在拟南芥植物中，细胞质中的GAPC核定位和活性，可被H2S通过硫巯基化活性位点Cys156所加强[34]，继而硫巯基化的GAPC进入细胞核，与转录因子核因子Y亚单位C10(factor nuclear factor Y subunit C10,NF-YC10)结合，最终促进热胁迫响应基因表达，提高拟南芥的耐热性[35]。如上所述，GAPC是EMP途径的关键酶，通过H2S硫巯基化增强的活性可促进糖代谢，继而降低细胞糖水平，削弱糖信号及维持能量平衡。此外，免疫化学和蛋白组学手段证实，糖代谢的其他关键酶LDH、MDH和PDH也能被H2S进行硫巯基化，继而提高它们的活性和促进糖代谢[11,36]。相反，H2S也可通过硫巯基化抑制ME和ICDH的活性，继而削弱糖代谢，提高胞内糖水平和引发糖信号，重新调解能量平衡[36]。然而，这些酶的确切硫巯基化位点需要进一步用质谱分析法确定。GAPC的活性位点Cys160也可被NO进行亚硝基化修饰，继而抑制它的活性，而亚硝基化的GAPC又可被H2S硫巯基化修饰恢复其活性[36]，进一步支持H2S与NO信号的交互作用。这些研究结果暗示，植物细胞糖水平受H2S触发的硫巯基化修饰调控，也就是H2S通过硫巯基化与糖信号交互作用。

2.5 与激素信号的交互作用

植物激素如ABA、乙烯(ethylene,ETH)和褪黑素(melatonin,MEL)，是植物整个生活史的关键调解者。它们不仅调解细胞分裂和分化，也调解植物的生长发育和响应逆境[37]。植物激素通常通过它们的受体和下游信号蛋白发挥作用。如ABA可通过它的受体帕雷巴克汀抵抗蛋白/ABA受体调节组分(pyrabactin resistance/regulatory component of ABA receptor,PYR/RCR)发挥作用。当ABA与PYR/RCR结合时，继而抑制蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)的活性。PP2C的抑制继而激活蔗糖非发酵相关蛋白激酶(sucrose non-fermenting related protein kinase,SnRK)，最终通过磷酸化激活下游的信号蛋白，进一步传递ABA信号[38]。此外，1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthetase,ACS)和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid oxidase,ACO) 是ETH合成的限速酶[37,39]。此外，5-羟色胺N-乙酰转移酶(serotonin N-acetyltransferase,SNAT)和N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶(N-acetylserotonin methyltransferase,ASMT)是MEL合成的关键酶，维持细胞中MEL稳态[40]。

在模式植物拟南芥中，ABA不敏感4(ABA insensitive4,ABI4)是ABA信号途径中的重要转录因子，它的活性位点Cys250可被H2S硫巯基化，继而能紧密地结合到DES1和促分裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶18 (mitogen activated protein kinase kinase kinase18,MAPKKK18)的启动子上，从而传递H2S和ABA信号，最终调节种子萌发、幼苗建成和气孔运动[13]。在番茄幼苗中，ETH能诱导内源H2S产生，继而硫巯基化ACO的活性位点Cys60，抑制它的活性和减少ETH的产生，响应渗透胁迫[39]。此外，Chen等[38]报道拟南芥中SnRK2.6的活性位点Cys131和Cys137也能被H2S硫巯基化，实现ABA信号传递和ABA诱导的气孔关闭。最近，运用免疫化学手段证实拟南芥中H2S能硫巯基化SNAT和ASMT，从而显著增加它们的活性和MEL的水平，通过气孔关闭来响应渗透胁迫[40]。蛋白组学手段也初步证实，PYR/RCR、钙依赖蛋白激酶(Ca2+-dependent protein kinase,CPK)和PP2C能被H2S硫巯基化，继而增强PYR/RCR和CPK，抑制PP2C，导致气孔关闭和改变其他生理过程[11]。这些结果表明，H2S通过硫巯基化至少与植物激素ABA、ETH和MEL交互作用。然而，SNAT、ASMT、PYR/RCR、CPK和PP2C的确切硫巯基化位点，需要进一步阐明。

2.6 与其他信号分子的交互作用

植物CPK是解码钙信号的钙结合蛋白成员之一，能被Ca2+活化[25]。如上所述，CPK能被H2S硫巯基化[24]，暗示H2S通过硫巯基化与钙信号交互作用。Aroca等[11]报道拟南芥蛋白组中至少5%(大约2 015个蛋白)可能被H2S硫巯基化，这些蛋白涉及光受体向光素(phototropin,PHOT)、隐花色素(cryptochrome,CRY)和UV-B受体UV-B抵抗蛋白8(UV-B resistance 8,UVR8)，暗示H2S与光信号的交互作用，调控植物的光形态建成和气孔运动。此外，谷氨酸作为植物信号分子，谷氨酰胺合成酶能将它转变为谷氨酰胺[41]，而谷氨酰胺可被H2S硫巯基化并抑制其活性[11]，继而导致谷氨酸的积累，触发谷氨酸信号。大约3.8% (1 537个蛋白)和2.3% (927个蛋白)的拟南芥蛋白组中的蛋白可被H2O2和NO氧化[11,32]。所以，翻译后修饰硫巯基化、次磺酰化和亚硝基化可能拥有共同的靶蛋白，继而进一步支持H2S、H2O2和NO在植物适宜条件和逆境胁迫下的交互作用。但是，上述蛋白的硫巯基化位点需要用质谱分析法和免疫化学法进一步确定。

此外，由MG、丙二醛、壬烯醛、丙烯醛等组成的活性羰基(reactive carbonyl species,RCS)，不仅是细胞毒害剂，也是信号分子[42]。Schreier等[43]首次报道H2S可能是壬烯醛的化学靶。他们发现H2S可保护壬烯醛对SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞的毒害作用及对壬烯醛相关蛋白的修饰，说明H2S是重要的羰基胁迫拮抗剂。在烟草中，ABA可诱导保卫细胞中H2O2的积累，继而增加内源RCS水平，导致气孔关闭[44]，暗示RCS参与植物干旱胁迫响应。H2S也可通过ROS信号调节气孔运动[24]。在玉米幼苗中，MG能提高它们的耐热性，且H2S在MG的下游发挥信号作用[9]。表明研究暗示H2S与RCS在植物逆境胁迫下的交互作用，但它们交互作用是否通过硫巯基化，尚未清楚。

3 结论与展望

越来越多的证据证实，低浓度的H2S作为一种新的信号分子，调节从种子萌发到器官衰老的整个生活史。通常，植物中的H2S通过引发下游的信号转导途径而发挥生理作用。多条植物信号转导途径彼此交互作用，构成一个复杂而尚未解决的信号网络。信号网络能放大或削弱信号分子的作用，继而调节与植物生长发育和响应逆境相关的基因表达，从而改变生理生化过程和细胞代谢。近年来，研究发现植物中成百上千的蛋白可被H2S硫巯基化。硫巯基化由于产生别构效应，可改变靶蛋白的结构、活性、稳定性和亚细胞定位，从而调节植物细胞代谢。H2S触发的蛋白质硫巯基化，涉及许多信号分子如H2S、ROS、NO、糖和植物激素的代谢酶和信号蛋白，从而实现这些信号之间的交换作用。

虽然H2S通过硫巯基化与ROS、NO、糖和植物激素之间的信号交互作用已在生理和逆境条件下都被证实，但是涉及H2S触发蛋白质硫巯基化的许多科学问题需要进一步解码。蛋白组学和免疫化学手段初步证实信号分子代谢酶(如LCD、DCD、OASTL、NR、PDH、LDH、Rubisco、SNAT、ASMT等)和信号蛋白(如PYR/RCR、CPK、PP2C、PHOT、CRY、UVR8等)可被H2S硫巯基化，但具体的硫巯基化位点，尚未清楚。此外，信号分子H2S、ROS、NO、糖和植物激素(如生长素、赤霉素、细胞分裂素、油菜素内脂、茉莉酸、水杨酸、独脚金内酯等)的其他代谢酶和信号蛋白是否可被H2S硫巯基化，也需要用蛋白组学、免疫化学、质谱分析、基因突变等手段进一步探索。