青稞根瘤菌的分离及其多基因分类鉴定

周 洁,周子琼,潘 虎,,卢向阳,张一帆,田 云

(1.湖南农业大学 生物科学技术学院，长沙 410128；2.西藏自治区农牧科学院 农业质量标准与检测研究所，拉萨 850032；3.西藏农牧学院 食品科学学院，林芝 860000)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum Hook.f.)作为禾本科大麦属的农作物，是青藏高原第一大农作物。西藏高寒、低温、缺氧等极端环境造成土壤微生物活性较低，导致青藏高原土壤较为贫瘠[1-2]。根瘤菌包括共生固氮细菌和非共生固氮细菌等，是土壤生态系统中氮素转换和循环的主要动力，在整个土壤生态系统中起着不可替代的作用[3-4]。根瘤菌对青稞的生长和发育起着重要作用，同时青藏高原的独特气候条件也造就了独特的根瘤菌种群。但目前有关青稞农田土壤中根瘤菌的研究较少，特别是低温环境下可培养根瘤菌的研究尚属空白[5-6]。本文采用低温纯培养技术从西藏昌都市青稞种植农田土壤中分离得到两株根瘤菌疑似新种，针对上述菌株开展了部分生理生化和多基因的初步鉴定，为丰富高寒地区根瘤菌种质资源提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

2018年4月7日于西藏昌都市边坝县拉孜乡珠村(30°55′48.9″N,94°58′13.4″ E,海拔高度:4011m)按照五点取样法采集青稞农田土壤样品，土壤样品混匀后用无菌塑封袋封装，-18℃保存备用。R培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，麦芽糖提取物5.0g，酪蛋白氨基酸5.0g，牛肉提取物2.0g，甘油2.0g，吐温-8050.0mg，MgSO4·7H2O1.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.6。M5培养基：酵母膏4.0g，可溶性淀粉15.0g，K2HPO41.0g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.6(含25μg/mL萘啶酸和100μg/mL制霉菌素)。LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1菌株的分离与纯化

将土壤样品混匀后取约5g置于含50mL 灭菌蒸馏水的三角瓶中，25℃、180r/min 振荡摇匀10min，静置30s后取1mL 菌液梯度稀释至10-3、10-4和10-5，均匀涂布于R和M5分离培养基上，接种量为0.05mL，每组处理设3个重复。4℃培养60d后挑取明显菌落于LB固体培养基上反复划线至纯培养物。

1.2.2菌株的形态学观察和生理生化鉴定

供试菌株形态学观察和生理生化鉴定参考文献[7]。最适生长温度、起始pH值、盐度等培养条件参考凌娟等[8]。

1.2.3菌株基因组DNA的提取及16S rRNA序列的测定

采用TIANGEN公司细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取菌株总DNA，具体步骤按说明书操作，所提取总DNA于-20℃保藏备用。用提取的总DNA为模板，采用PCR法扩增16S rRNA基因序列片段，PCR反应体系和扩增程序参考Heng等[9]，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后送至南京金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.2.4菌株6对管家基因的序列测定

采用ATP操纵子(atpD)、重组蛋白A(recA)、RNA聚合酶β亚基(rpoB)、苏氨酸合酶(thrC)和谷氨酰胺合成酶(glnII和glnA)共6对管家基因进行菌株的多基因初步鉴定[10]，扩增引物见表1，多基因PCR反应体系和扩增程序参考1.2.3进行。

表1 6对管家基因扩增引物Table 1 The amplification primers of 6 pairs housekeeping gene

1.2.5 基因序列分析与系统发育树的构建

采用NCBI、EzBioCloud等数据库开展Blast比对分析，采用CLUSTAL X软件进行多基因列比对，利用MEGA 7.0中的最大似然估计法(Maximum-likelihood)建立供试菌株序列系统发育树[11]。

2 结果与分析

2.1 菌株T786和T808的形态学和生理生化特征

经过60 d的低温培养，从R和M5培养基上分别纯化得到23株和20株细菌，经过筛选从R和M5培养基上分别挑选1株细菌(编号为T786和T808)进行后续研究。常温下，菌株T786和T808在LB培养基上2～3 d可形成1 mm左右的菌落，革兰氏阴性菌、短杆状、菌落圆形、乳白色、光滑、有光泽、中间凸起、边缘整齐、表面湿润不透明(图1)。菌株T786和菌株T808的主要生理生化特征及碳氮利用情况见表2。

表2 菌株T786和T808的主要生理生化特征及碳氮源利用情况Table 2 The main physiological,biochemical characteristics and utilization of carbon and nitrogen sources of strains T786 and T808

图1 菌株T786和T808在LB平板上的形态特征Figure 1 The morphological characteristics of strains T786 and T808 on LB plate

2.2 菌株T786和T808的16S rRNA鉴定

菌株T786和T808的16S rRNA基因测序结果经EzBioCloud数据库比对分析显示：菌株T786与标准菌株NeorhizobiumvignaeCCBAU 05176T、NeorhizobiumalkalisoliCCBAU01393T、NeorhizobiumtomejilenseT17_20T、NeorhizobiumhuautlenseS02T、NeorhizobiumgalegaeATCC43677T和“Neorhizobiumlilium24NRT”的相似度分别为98.70%、98.47%、98.24%、98.16%、97.79% 和 96.55%。菌株T808与标准菌株PararhizobiumherbaeCCBAU83011T、PararhizobiumpolonicumF5.1T、PararhizobiumgiardiniiH152T、PararhizobiumantarcticumNAQVI 59T、PararhizobiumsphaerophysaeCCNWGS0238T、PararhizobiumcapsulatumIFAM 1004T、PararhizobiumhaloflavumXC0140T的相似度分别为98.79%、98.65%、98.50%、98.69%、98.36%、97.05%和95.58%。菌株T808的16S rRNA基因Clustal X比对发现，该菌株较Pararhizobium属菌株在16S rRNA基因的V1～V2区存在40 bp左右的碱基插入，但该菌株与Uncultured bacterium clone barrow_FF_26 (JX668750.1)、Rhizobiumsp.Ia8 (KF444807) 和Rhizobiaceae bacterium strain FW305-C-27(MN067584)等3株未培养微生物却不存在上述差异，表明菌株T808与Pararhizobium属现存的7个微生物种类差异较大(图2)。

图2 菌株T808的16S rRNA基因V1～V2区Clustal X分析结果Figure 2 The Clustal X analysis of V1-V2 region of 16S rRNA gene in strain T808

通过菌株T786和T808的16S rRNA基因序列及EzBioCloud数据库中与其相近标准菌株所建立的系统进化树(图3)，结果显示菌株T786和T808处于单独的进化分支，且与其相近参考标准菌株存在明显进化分歧，故推测上述菌株为潜在的根瘤菌新种，将其分别命名为Neorhizobiumsp.T786和Pararhizobiumsp.T808。

图3 菌株T786和T808及其相关菌株的16S rRNA序列系统进化聚类图Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of T786,T808 and related species

2.3 菌株T786和T808的6对管家基因的鉴定

菌株T786和T808的6对管家基因相似度和多基因平均核酸一致性(average nucleotide dentity，ANI)值均远小于根瘤菌新种阈值(95%～96%)[12]，菌株T786和T808为潜在的根瘤菌新种(表3和表4)。

表3 菌株T786与相似标准菌株的6对管家基因相似度Table 3 The similarity of 6 pairshousekeeping genes between T786 and similar standard strains

表4 菌株T808与相似标准菌株的6对管家基因相似度Table 4 The similarity of 6 pairshousekeeping genes between T808 and similar standard strains

3 讨论与结论

根瘤菌是一类革兰氏阴性细菌，主要归属于原核生物细菌域、变形杆菌门下的α-变形杆菌纲和β-变形杆菌纲，共17属[4]，它能够侵染豆科作物、牧草、树种植物的根部或茎部形成共生体根瘤(或茎瘤)，并在其中将空气中的游离态的氮气转化成植物可以利用的化合态氮，为宿主植物的生长提供必需的氮素营养[13]，但近年来越来越多的缺失固氮和结瘤功能的根瘤菌被发现[14-16]。研究表明16S rRNA 基因相似性为98.65%是细菌种水平分类的重要阈值[17]，但16S rRNA基因作为细菌分类鉴定的重要手段具有一定的局限性，同时由于根瘤菌系统进化的保守性等原因，即便16S rRNA相似度高达99.0%的根瘤菌，仍然可能是不同的物种。atpD、recA、rpoB、thrC、glnII和glnA等管家基因具有较高的稳定性、普遍性和分辨率,适合作为种系分类的分子标记，管家基因相似性为95%～96%作为不同细菌物种分类的阈值具有较高的可靠性[18-19]，其作为16S rRNA 基因初步分类的重要补充得到广泛应用。本文对西藏昌都市青稞种植农田土壤分离菌株T786和T808的atpD、recA、rpoB、thrC、glnII和glnA等6对管家基因序列分析显示，菌株Neorhizobiumsp.T786和Pararhizobiumsp.T808的6对管家基因相似度和多基因ANI值均远小于根瘤菌新种95%～96%的阈值，菌株T786和T808为潜在的根瘤菌新种，Pararhizobium和Neorhizobium是近年来由Mousavi等[10,20]提出的根瘤菌新属，菌株T786和T808的发现对丰富Pararhizobium和Neorhizobium属新物种和青藏高原地区根瘤菌种质资源具有重要的意义，为西藏本土农业微生物资源的开发与利用提供重要材料。