长链非编码RNA在肝纤维化发生发展中的作用研究进展

贾刚刚，吴承骏，卢利霞，郑英，王俊科，于晓辉

1 兰州大学第二医院消化内科，兰州 730030；2 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院消化内科

肝纤维化是肝内结缔组织异常增生、正常结构扭曲的病理过程，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病及胆汁淤积性肝病等慢性肝病的创伤愈合反应。肝纤维化的发生主要与肝星状细胞（HSCs）活化、炎性介质释放、上皮间质转化等因素相关，但并未完全阐明肝纤维化发生的分子机制。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt并且可以在多个层面调控基因表达的RNA，其调控作用主要表现在表观遗传调控、转录调控和转录后调控。lncRNA 可以作为海绵分子吸附一些特定的microRNA，进而调控microRNA 靶基因的表达，这种作用方式被称为“海绵效应”，具备该特征的lncRNA 被 称为 竞 争性 内 源RNA（ceRNA）［1］。lncRNA 在肝纤维化发生及进展中发挥不同作用，大部分发挥促进作用，少部分发挥抑制作用，极少数lncRNA 具备促进和抑制肝纤维化发生的双重作用。现就lncRNA 在肝纤维化发生发展中的作用研究进展情况综述如下。

1 lncRNA在肝纤维化发生发展中的促进作用

在肝纤维化发生进程中，有些lncRNA 发挥促进作用，包括肺腺癌转移相关转录本1、lncLFAR1、lncRNA HULC、lncRNA HEIH、lncRNA-ATB、浆细胞瘤变型异位因子1、核旁斑组装转录本1、小核RNA宿主基因7等。

1.1 肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1） MALAT1是一种广泛表达的lncRNA，在人类的早期非小细胞肺癌中首次发现，位于人类染色体11q13.1，长约8 kb，在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭中发挥重要作用。MALAT1在各类疾病中的表达失调及其作用机制已被广泛研究，在肝纤维化方面，WU 等发现其通过抑制沉默调节蛋白1（SIRT1）的表达和功能促进肝纤维化的发展［2］。SIRT1 属于哺乳动物sirtuin 蛋白家族的成员，是一种依赖于烟酰胺腺苷二核苷酸的去乙酰化酶，具有对底物去乙酰化功能的基因，参与多种生物过程，对一些转录因子的去乙酰化可以保护细胞免受代谢、缺氧及基因等损伤。TGF-β 是一种来自自分泌或旁分泌途径的促纤维化细胞因子，是促进HSCs 活化的关键信号分子，也是肝损伤—炎症—纤维化病理过程中的关键调节因子。在TGF-β信号通路中，SIRT1能引起下游蛋白Smad3的去乙酰化，并且降低与Smad3 相关纤维基因启动子的功能，如胶原蛋白Ⅰ型基因启动子，这意味着SIRT1 的激活能够减弱TGF-β 信号转导，从而减少胶原蛋白的表达。据此推测MALAT1可能通过阻断SIRT1 介导的TGF-β 信号通路在肝纤维化进程中的抑制作用，进而促进HSC 的激活，导致肝纤维化的发生。国内研究［3］发现，MALAT1 还参与腹膜间皮细胞纤维化的形成。WANG 等进一步通过对151 例肝纤维化患者进行研究，发现MALAT1 可通过海绵化miR-181a，作用于TLR4，进而激活NF-κB 信号通路，促进肝纤维化的发生。此外有研究［4］发现，MALAT1/PTBP1/USP8/TAK1 信号可以轴通过巨噬细胞凋亡和M1 极化促进肝纤维化的发生。MALAT1 还可通过海绵化miR-101b 来调节RAS 相关的C3 肉毒毒素底物1（Rac1）的表达，从而影响HSC 的增殖、细胞周期及活化［5］。也有研究者发现，在亚砷酸盐诱导的肝纤维化中，来自肝细胞的外泌体MALAT1 可以通过海绵化miRNA-26b 参与HSCs的活化。这些研究结果表明，MALAT1 在肝纤维化的发生中扮演促进作用，同时提示了参与纤维化发生的机制。

1.2 肝纤维化相关的lncRNA1（lncLFAR1）lncLFAR1转录本最初在小鼠肝脏中发现，位于人类染色体4q25，长约734 nt。lncLFAR1 的启动子中有三个潜在的Smad2/3 结合位点，Smad2/3 可以与lncLFAR1 基因的启动子结合并促进其表达，在肝纤维中，lncLFAR1 可以上调Smad2/3 的表达并促进其磷酸化［6］。Smad2/3 的磷酸化进一步增强了其与目标启动子结合的能力，如Ⅰ型胶原蛋白基因。因此，lncLFAR1 可能通过与TGF-β 信号通路相互作用诱导HSCs 活化促进肝纤维化。研究还发现，lncLFAR1 可以通过Notch 通路促进肝纤维化。

1.3 lncRNA HULC、HEIH lncRNA HULC 和lncRNA HEIH 均在肝癌中首次发现。HULC 基因位于人类染色体6p24.3，长约500 个核苷酸。在非酒精性脂肪性肝病的大鼠模型中，抑制HULC 可以通过MAPK信号通路改善肝纤维化和肝细胞凋亡。在HBV 相关肝硬化患者的血浆中，Treg 细胞和HULC表达明显上调，HULC通过直接下调p18水平来调节Tregs 细胞的表达及功能，进而促进肝纤维［7］。此外，HEIH、HULC还可通过调控乙肝病毒X蛋白结合蛋白影响HBV 相关肝纤维化和肝细胞癌的发生和进展。因此，对CHB 患者，HULC 和HEIH 可能是肝纤维化潜在的诊断标志物。

1.4 TGFβ 激 活 的 lncRNA （lncRNA-ATB）lncRNA-ATB 是一种新发现的致癌lncRNA，位于人类第14 号染色体，长约80 kb。HCV 相关肝纤维化患者的肝组织和血浆中lncRNA-ATB 表达水平升高，并且在血浆中其水平与肝纤维化阶段明显相关，lncRNA-ATB 的敲除抑制α-SMA 和Ⅱ型胶原蛋白的表达。lncRNA-ATB通过与miR-425-5p、miR-200a竞争性结合来激活HSC 并且增加胶原蛋白的产生，从而促进HCV 诱导的肝纤维化。最近研究发现，血浆lncRNA-ATB 可作为HBV 相关肝硬化的特异性生物标志物，其灵敏度为61.36%，特异度70.00%。据此，对于HBV、HCV 的患者，lncRNAATB可以作为其潜在诊断标志物和治疗靶点。

1.5 浆细胞瘤变型异位因子1（PVT1） PVT1 是lncRNA 的一种，人类PVT1 基因位于染色体8q24，参与肿瘤的增值、迁移等过程，在胃癌、胆囊癌等组织中高表达。研究［8］表明，PVT1 在肝纤维化组织和活化的HSC 中高表达，PVT1 通过竞争性结合miR-152 下调Hedgehog 通路中PTCH1 表达，从而促进肝纤维化中的EMT 过程。在小鼠肝纤维化组织中，PVT1过表达并且自噬水平明显升高，PVT1和自噬均与缺氧有关，缺氧诱导的自噬依赖于HSC 中PVT1 和miR-152 的表达，荧光素酶基因检测表明自噬相关基因14（ATG14）是miR-152 的直接靶标，PVT1/miR-152/ATG14 信号轴介导缺氧条件下HSC的激活，并且自噬水平升高［9］。综上，lncRNA-PVT1作为ceRNA 通过竞争性结合miR-152促进肝纤维化的发生，但具体机制仍不明确。

1.6 核旁斑组装转录本1（NEAT1） NEAT1 是细胞核中亚细胞结构旁斑中的重要组成元件，在旁斑的构建和mRNA 的出核中发挥重要作用。NEAT1在胃腺癌［10］、肝癌［11］等肿瘤中表达上调。临床研究［12］发现，肝纤维化患者血清NEAT1 明显高于非肝纤维化患者。进一步动物实验发现，与对照组相比，CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏中NEAT1表达增加，而抑制NEAT1可逆转肝纤维化，同时降低α-SMA和Ⅰ型胶原纤维含量，这在NEAT1 敲除实验和过表达试验中得到证实。NEAT1 通过竞争性结合miR-122促进HSC 活化，还可通过调节miR-122 加速肝纤维化的进展。酒精性脂肪性肝炎患者MiR-129-5p 的水平降低，而NEAT1 和细胞因子信号2（SOCS2）升高，抑制NEAT1或过表达miR-129-5p可抑制乙醇刺激的AML-12 细胞中的炎症反应和肝纤维化，此外NEAT1 可 以靶向SOCS2 负调节miR-129-5p［13］。荧光共定位分析显示，NEAT1 与miR-139-5p 均表达于活化的HSCs 细胞质中，miR-139-5p 上调可以抑制β-catenin表达，β-catenin过表达可以促进HSCs的活化。NEAT1 的敲除和miR-139-5p 过表达可以减轻小鼠肝纤维化，NEAT1 通过竞争性结合miR-139-5p而加剧肝纤维化［14］。体外模型研究［15］证实，NEAT1通过海绵化miR-506 靶向GLI3 促进非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化。最近研究［16］表明，NEAT1 基因通过竞争性结合miR-148a-3p 和miR-22-3p 来调控哺乳动物中与胰岛素变构信号相关的细胞黏着因子3的表达，来抑制肝纤维化和造血干细胞的活化过程，这表明抑制NEAT1可以抑制肝纤维化，NEAT1可成为肝纤维化的潜在治疗靶点。

1.7 小核RNA 宿主基因7（SNHG7） SNHG7 是一种全长2 176 bp 的致癌lncRNA，位于人类染色体9q34.3，在癌症中被广泛研究。在肝纤维化小鼠模型中，SNHG7 表达增加，SNHG7 敲除实验显示α-SMA 和Ⅰ型胶原蛋白的表达水平下降。在肝纤维化小鼠模型中，SNHG7 表达增加，SNHG7 敲除后肝纤维化相关蛋白表达下降［17］。自噬相关基因Beclin1 是自噬过程中重要的正调节因子，主要诱导自噬的启动，微管相关蛋白1 轻链3（LC3）是自噬小体形成的关键蛋白，下调SNHG7 可以降低Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达水平，说明下调SNHG7 具有抑制HSCs 自噬的作用，而自噬可以促进肝纤维化的发展。进一步机制研究［17］发现，SNHG7 的下调与DNMT3A 的低表达水平显著相关，SNHG7 作为ceRNA 通过与miR-29b 结合来影响下游靶基因DNMT3A 的表达，进而影响HSCs 的活化、促进自噬和增殖。SNHG7还可通过竞争性结合miR-378a-3p促进HSCs 的活化。总之，SNHG7 与肝纤维化密切相关，但具体机制仍不明确。

1.8 牛磺酸上调基因1（TUG1） TUG1 除了参与肿瘤发生，还调控不同癌细胞的生物学行为和分子机制，包括细胞增殖、侵袭、凋亡、分化、迁移等过程。小鼠模型研究显示，TUG1 水平在肝纤维化组织和活化的HSCs 中明显升高，沉默TUG1 通过抑制TGF-β1信号通路改善肝纤维化病理损害。TUG1 通过竞争性结合miR-29b 参与肝纤维化的发展和HSCs的激活［18］，此外还可海绵化miR-142-3p调节自噬调控的肝窦内皮细胞内皮的EMT，进一步促进肝纤维化的发展［19］。对LPS诱导的肝炎小鼠模型的研究表明，沉默TUG1 可以通过miR-140，直接靶向TNF-α 而减轻肝脏炎症反应。TUG1 在肝脏炎症和纤维化的发展中发挥重要作用。

1.9 同源盒转录反义RNA（HOTAIR） HOTAIR是一种癌症相关的lncRNA，位于染色体位点7p15，长约4 665 bp。研究［20］发现，在CCI4 诱导的肝纤维化小鼠模型中，HOTAIR 高表达，体外研究发现过表达HOTAIR 可促肝细胞增殖和活化。进一步机制研究发现，HOTAIR 通过竞争性结合MiR-29b 表观调控抑癌基因PTEN 表达，以此促进肝纤维化的发展［21］。过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）是核受体家族的成员，也是调节细胞核基因表达的一种蛋白，功能多样，在调节细胞分化、发育和新陈代谢等方面发挥重要作用。罗格列酮是PPAR 高效激动剂，其通过上调MiR-124-3p 抑制HSCs 活化以减轻肝纤维化，并且罗格列酮的抗肝纤维化作用可以被HOTAIR的表达所逆转［22］。

2 lncRNA在肝纤维化发生发展中的抑制作用

参与调控肝纤维化的lncRNA 大部分发挥促进作用，少部分发挥抑制作用，包括母系表达基因3（MEG3）、生长停滞特异转录因5（GAS5）、长基因间非编码RNA-p21（lincRNA-P21）。

2.1 母系表达基因3（MEG3） MEG3 是lncRNA 的一种，编码MEG3 的核苷酸长度约为1.6 kb，位于人染色体14q32。MEG3在胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤中均有抑癌作用［23］。在CCI4 诱导的肝纤维化模型中，核苷酸结合结构域受体家族含CRAD 结构域-5（NLRC5）可能是MEG3作用的靶点，MEG3可能通过靶向NLRC5 抑制HSCs 的活化，进而促进肝纤维化的逆转。进一步研究发现，慢性乙型肝炎（CHB）患者血清外泌体MEG3 低表达，与肝纤维化程度呈负相关［24］。因此，lncRNA MEG3可作为CHB 患者的一种预后标志物。YU 等［25］指出，Hedgehog 通路可以调控肝纤维进程中的EMT，通路中的激活性受体SMO 蛋白参与其中，MEG3 可以作为ceRNA与miR-212 互相作用，MEG3 和miR-212 相互作用靶向SMO蛋白抑制Hedgehog通路介导的EMT，进而逆转肝纤维化的形成。PPAR 在肝纤维化的发生中发挥重要调节作用，MEG3 可以作为ceRNA 海绵化miR-145 靶向PPARγ 而影响HSCs 的活化［26］。研究发现，N-乙酰半胱氨酸可以通过调节神经MEG3/蛋白酶激活受体2（PAR2）/NF-κB 轴减轻与肝硬化相关的周围神经病变。因此，MEG3 可能是肝纤维化潜在的治疗靶点。

2.2 生长停滞特异转录因5（GAS5） GAS5基因位于人染色体1q25，由12 个外显子组成。研究发现，晚期纤维化患者的血浆GAS5 的表达显著高于非纤维化患者，并且随着纤维化的进展，血浆中的GAS5表达增加。细胞水平研究发现，GAS5低表达促进肝纤维化进程，这一过程与启动子甲基化有关［27］。动物实验表明，肝纤维化的进展与血浆GAS5 的表达呈线性相关，这提示血浆GAS5 可能成为慢性肝病患者肝纤维化的诊断标志物。进一步机制研究发现，GAS5 可以海绵化miR-23a，进而调控PTEN 的转录，抑制肝纤维化的进展。体外实验验证了GAS5还可通过调节miR-433-3p/TLR10 轴调控NF-κB 转录因子来抑制LX-2 细胞的活化。因此，GAS5 可作为慢性肝病患者肝纤维化诊断的生物标志物［28］。

2.3 长基因间非编码RNA-p21（lincRNA-P21）lincRNA-p21 位于人类染色体6p21.2，长度约3.0 kb，在DNA 损伤反应、细胞凋亡、增殖等不同生物学过程中发挥关键调节作用。一项研究显示，肝纤维化患者血清lincRNA-p21 的水平与α-SMA 和Ⅰ型胶原蛋白呈负相关，lincRNA-p21 过表达有助于抑制HSC 活化、增殖并诱导α-SMA 和Ⅰ型胶原蛋白显著减少［29］。机制研究表明lincRNA-p21 的过表达促进了p21 在mRNA 和蛋白质水平上的上调［30］。同时，lincRNA-p21 诱导的这些作用可被PTEN 的缺失所阻断，lincRNA-p21 除了通过竞争性结合miR-181b增强PTEN 表达，还可竞争性结合miR-17-5p，作用于β-catenin 通路来逆转肝纤维化的进展。综上所述，血清lincRNA-p21 可作为肝纤维化潜在的治疗靶点。

3 lncRNA在肝纤维化发生发展中的双重作用

lncRNA H19在肝纤维化调控中发挥双重作用，即发挥促进作用，也发挥抑制作用。

3.1 lncRNA H19 的促进作用 lncRNA H19 是由H19 基因编码的一种lncRNA 分子，位于人染色体11p15.5，长约2.3 kb，在很多种癌症中过度表达。无论是小鼠模型还是原发性硬化性胆管炎（PSC）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者，肝脏H19 的水平都与肝纤维化的严重程度密切相关，胆管细胞来源的外泌体H19 通过促进HSC 的活化，在胆汁淤积性肝纤维化的进展中发挥关键作用［31］。ZEB1 是锌指蛋白相关转录因子家族成员之一，可以与靶基因启动子上E-box 基序结合，调节基因的转录。研究［32］发现，肝脏中lncRNA H19 通过与ZEB1 转录因子的结合而促进小鼠胆汁淤积性肝纤维化。除此之外，在胆道闭锁相关性肝纤维化中，其肝损伤程度与H19 水平也相关，H19 不仅可以通过调节胆汁酸诱导的鞘氨醇1-磷酸受体2（S1PR2）和鞘氨醇激酶2（SphK2）的表达和激活促进肝纤维化，还可海绵化microRNA let-7 导致结构性转录因子HMGA2 的上调，上述两种机制在胆汁淤积性肝纤维化中发挥关键作用［33］。研究［34］表明，单核细胞或巨噬细胞CD11B mRNA水平在胆道闭锁患者的肝脏中显著增加，并且与肝脏炎症和纤维化的程度呈正相关，条件性巨噬细胞耗竭可以通过H19抑制胆汁淤积性肝损伤和纤维化。此外，lncRNA-H19可以通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化，加速脂滴降解和脂质氧化而促进肝纤维化，双氢青蒿素可以通过减少由缺氧诱导因子1 亚基α（HIF1α）驱动的H19 转录进而抑制由AMPK磷酸化介导的脂质氧化来逆转肝纤维化的发生。综上，胆管细胞来源的外泌体H19在胆汁淤积性肝纤维化的发生发展中发挥重要作用，可能成为胆汁淤积性肝纤维化的治疗靶点和非侵入性诊断标志物。

3.2 lncRNA H19 的抑制作用 lncRNA H19 在肝纤维化中的作用尚不明确且机制复杂。活化的HSCs和大鼠肝纤维化组织中H19的表达降低，同时伴有DNA 甲基转移酶1（DNMT1）的过表达和H19启动子的甲基化，并且DNMT1的敲除可以提高活化HSCs 中H19 的表达，而DNMT1 的过表达抑制了活化HSCs中H19表达。这提示lncRNA H19可能通过调控靶基因的甲基化进而抑制肝纤维化的发生。CpG 结合蛋白2（MeCP2）是甲基化结合蛋白家族中的主要成员，可以通过与甲基化DNA 的结合抑制其下游靶基因的转录。H19是造血干细胞中胰岛素样生长因子1 受体（IGF1R）的潜在调控因子，H19 的MeCP2 沉默可使IGF1R 过表达，从而促进HSCs 增殖，H19 的过表达可抑制IGF1R 的表达和HSC 的激活。综上，lncRNA H19 可能通过调控DNA 甲基化影响IGF1R的表达抑制肝纤维化的进展。MeCP2是肝纤维化潜在的治疗靶点。

综上所述，lncRNA 可能参与肝纤维化的发生发展进程，在肝纤维化中发挥重要作用，主要表现为促进、抑制及双重作用。lncRNA 可能是临床诊断肝纤维化的生物标志物，lncRNA 本身及其互作蛋白或靶基因有可能成为肝纤维化新的治疗靶点。