透明质酸及其衍生物在预防术后粘连中的应用进展

李细艳，何琪，许发亚，肖雁冰，涂皎

遵义医科大学附属妇幼保健院，贵州 遵义 563000

术后粘连是腹部、盆腔、宫腔、关节及心脏手术后的常见并发症，可导致慢性疼痛及器官功能障碍等严重的不良反应，还增加了术中出血、穿孔、手术难度等风险［1］。透明质酸（HA）具有高弹性、无细胞毒性、可降解性以及良好的生物相容性等优点，在术后粘连预防方面有独特的优势，并且通过化学改性、物理改性及复合改性获取的HA 衍生物具备更为良好的生物学性能，在术后粘连预防方面具有更好的疗效［2］。HA 及其衍生物既可以单独使用，又可以联合纳米技术及负载细胞、生长因子、药物应用于术后粘连预防方面，可加速组织内源性修复过程，提高创面的修复质量，降低粘连发生率［3］。随着人们对抗粘连方法的不断探索，HA 及其衍生物对术后粘连的防治已达到了新的高度。现就HA及其衍生物在预防术后粘连中的应用进展情况综述如下。

1 HA在预防术后粘连中的应用

HA 的大分子网状结构通过与水形成氢键而结合大量的水，可调控渗透压、大分子物质的转运及细胞功能等，且它本身具有无免疫原性、可降解性及良好生物相容性等优点，是较理想的防粘剂。ZHANG等［4］在制备大鼠子宫角受损模型术后2 周的大体观察中发现，HA 组大鼠腹腔粘连稀疏，易钝性分离；然而在用氯化钠处理的对照组中，大鼠腹腔内可见致密粘连及新生血管，绝大多数粘连需通过尖锐器械才能分离。值得一提的是，该研究还发现HA 能减少粘连分解术后粘连重建，可显著降低粘连复发率，但该实验未进一步探讨其具体机制。为了探究HA 抗粘连的机制，WANG 等［5］研究发现，关节内注射HA 可降低胶原蛋白含量，减少滑膜组织炎症反应，增加关节液的粘度及其润滑功能，从而抑制关节内粘连形成，改善关节活动能力。在一项临床实验［6］中，将HA 凝胶用于拟剖宫产分娩的产妇，结果显示HA 不仅可有效改善红细胞聚集性、血细胞在全血中所占的容积百分比以及全血粘度等，还可降低炎症因子及粘连相关因子分泌，改善盆腹腔粘连情况，加速子宫复旧。HA 虽然具有抗粘连作用，但极易被体内的酶和自由基降解，且力学性能差，局部保留的时间短，以及与宿主组织之间的整合性方面仍有不足，无法保持持久的治疗效果［7］。

2 HA衍生物在预防术后粘连中的应用

由于HA 分子结构中不仅含有乙酰氨基、羧基和羟基等活性官能团，而且相对简单的重复结构，允许特定的修饰和大量基团的引入，可通过化学改性、物理改性及复合改性得到不同理化性质的HA衍生物，表现出良好的生物力学性能、生物降解性、稳定性，从而更好地被设计成满足各种需求的抗粘连剂。

2.1 化学改性的HA 衍生物 HA 可通过酯化、酰胺化、交联、接枝等化学改性方法改变分子质量及理化性质，从而获得具有新生物活性和功能的HA衍生物，与天然HA 相比，其表现出更强的机械性能和稳定性，不易被酶降解，从而拓宽了它的应用范围。以微生物发酵得到的HA 为原料，使用酯交联技术制成自体交联的PROTAHRE®可吸收凝胶，具黏稠性、延展性及高稳定性，可附着于涂抹的组织表面，形成一层防止组织粘连的可吸收屏障，以减少组织间病理性纤维化连接。CHEN 等［8］发现，PROTAHRE®凝胶可明显降低盆腔粘连发生率及炎症反应，且术后14 d 盆腔中未见凝胶残留。文献［9］报道，将透明质酸钠与1，4-丁二醇二缩水甘油醚反应合成HyFence LV®，透明质酸钠和羧甲基纤维素钠反应合成无色粘稠溶液Guardix-SOL®，两者均可作为分离受损组织的临时机械屏障和润滑剂，对接受腰椎间盘切除术的患者有减轻局部粘连及神经损伤相关症状的作用，且HyFence LV®抗黏附性能优于Guardix-SOL®。SAKAI 等［10］构建了一种由酚羟基修饰的HA 水凝胶，因该水凝胶含有葡糖氧化酶和辣根过氧化物酶，可通过与体液接触而触发交联反应，在损伤局部形成凝胶状态，方便用于不同手术部位。然而，HA 化学改性需要苛刻的反应条件，反应产率低，化学反应过程中还会产生有毒的副产品，并且使用的催化剂具有细胞毒性，限制了它的应用范围。

2.2 物理改性的HA 衍生物 利用化学改性制备HA 衍生物，虽能改善其物理性能，但化学试剂的使用可能存在细胞毒性或不必要的不良反应。CAI等［11］通过冻融技术制备了物理交联HA 冷冻凝胶，作为一种新型抗黏附生物材料，在体外实验中，交联HA 冷冻凝胶表现出良好的生物相容性，且其流变特性和生物降解性在冻融过程中可调控。动物实验结果显示，其可作为物理屏障分隔损伤组织与正常组织，改善粘连情况，并且实验中未发现明显的不良反应；另外，分子机制研究发现，HA 冷冻凝胶可通过调节纤溶系统和抑制炎症反应减轻腹膜黏附，是一种有前途的预防术后粘连的临床候选药物。与化学改性的HA 衍生物相比，通过物理改性得到的凝胶具有更高的安全性，但由于物理交联反应是可逆的，它的机械和化学稳定性易被光、PH值、温度等因素影响，在体内难以承受周围组织的压力，容易变形或塌陷。

2.3 复合天然材料的HA 衍生物 天然材料主要包括纤维素、壳聚糖（CS）、海藻酸钠等，具有优越的生物相容性、安全性和可降解性。将这些天然材料通过物理或化学方法与HA 进行复合既可以克服交联HA 易碎的缺陷，又能获得具有大小适宜的孔隙、仿生三维结构和良好理化性质等优势的防粘连产品。另外由于这些天然材料本身即具有防粘连、止血、促进创面愈合等作用，经过与HA 复合制备出的防粘剂，在增强防粘连功效的同时还可能获得抗菌、凝血、止痛、促生长等其他功效，这将在抗粘连方面具有广阔的应用前景。

2.3.1 HA 与纤维素复合 羧甲基纤维素（CMC）与HA 一样具有良好生物相容性、无毒性、无免疫原性和生物可降解性等优点，而且同样有预防粘连的功效。将HA 和CMC 复合，可使两者抗粘连的功效相互叠加，研制出既有一定机械强度又不影响伤口愈合的防粘连剂［12］。1996 年一种名为Seprafilm的防粘连薄膜被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床术后粘连预防，这种薄膜是将天然纤维素改性后制得CMC，再以碳二亚胺为交联剂，与HA 通过交联改性而制成。OZEKI 等［13］在大鼠腹膜粘连模型中发现，Seprafilm 可通过抑制受损腹部的糜酶活性、减少炎症胞数目和降低转化生长因子-β表达水平，阻止腹部组织间黏附形成。从Seprafilm用于临床以减少粘连至今已有数十年，调查显示无明显不良反应，不会导致机体产生炎症反应和免疫排斥反应，但其操作性差，不易在腹腔镜、心脏等手术中推广，因此，与薄膜屏障操作相关的技术障碍限制了它在常规临床实践中的使用。HONG 等［14］首先将天然纤维素通过碱化反应和醚化反应制成吸湿性强的羧甲基纤维素钠，再将其与透明质酸钠混合制成呈液状的Guardix-SL，将其涂抹在容易形成黏附的受伤部位，可在原位形成物理屏障，实验中用注射器将Guardix-SL 置于心脏损伤部位，结果表明Guardix-SL 有利于改善手术后心包粘连，较Seprafilm 而言使用更为方便，但该产品在组织中短时间内会被水解吸收并经肾脏排泄，其稳定性有待提高。

2.3.2 HA 与CS 复合 CS 是甲壳素经N-脱乙酰化得到的天然聚阳离子碱性多糖，结构中包含丰富的羟基、氨基，使其极易与HA 分子形成氧键，继而复合成具有抗菌、止血、促生长的抗粘连产品。CHEN 等［15］将聚N-异丙基丙烯酰胺接枝到CS 上，再与HA 结合形成热敏水凝胶，室温下呈现自由流动态，且具有可注射性，在31 ℃左右将转变为凝胶状态，该凝胶易于覆盖伤口并紧紧地黏附，临床使用便捷；研究发现，其可减少成纤维细胞的渗透，减少局部胶原纤维沉积，以此达到有效预防腹膜粘连的效果，并且安全无毒，对创面正常愈合无干扰作用。在临床上，大部分抗粘连产品对预防粘连分离术后新粘连形成的效果常常不尽如人意。SONG等［16］通过在CS 的N 位和O 位引入羧甲基得到N，0-羧甲基壳聚糖，并使用高碘酸盐氧化法制备醛基化HA，两者发生Schiff 碱反应制备一种可注射、可生物降解、无毒的高分子质量水凝胶，动物实验结果表明该水凝胶可使血液和腹腔灌洗液中组织型纤溶酶原激活物含量显著升高，这使得其具有较强的抗粘连作用，对人群中复发性粘连患者可能有较好的治疗效果，避免因粘连复发多次手术所造成的痛苦。

2.3.3 HA 与海藻酸盐复合 海藻酸钠是一种由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸构成的天然多糖类生物高分子，在创伤修复方面具有可提供湿润的接触环境、高透氧性、吸收创口渗出液、防止继发损伤等优点，将HA 与海藻酸钠混合可制得生物力学性能更好的复合物，延长HA 在体内的驻留时间。BACK 等［17］制成一种新型可吸收的HA/海藻酸钠微粒，该材料易于制备和使用，当其一旦与体液接触即可变成凝胶发挥物理屏障作用，改善术后粘连程度，促进伤口愈合，且该微粒在体内可被降解和吸收。在创面愈合过程中物理屏障在损伤部位保留时间是预防组织粘连的关键，NA 等［18］将HA包埋在轻度交联海藻酸盐中，得到一种稳定的可注射复合水凝胶，制作材料中的HA 完全降解的时间是4 d，而该水凝胶却能延长驻留时间至8 d，在大鼠腹膜/盲肠缺损模型中发现，与HA 和轻度交联海藻酸钠相比，其预防腹膜组织粘连的效果更明显，该结果的出现究其原因可能与复合水凝胶在受损组织保留的时间更长有关；更重要的是，该水凝胶无免疫原性，在创伤愈合过程中不会导致免疫反应影响正常愈合。

2.4 复合合成材料的HA衍生物 HA 复合合成材料主要包括聚己内酯（PCL）、ε-聚赖氨酸、Pluronic F127、γ-聚谷氨酸、聚乙二醇等，这些聚合物的生产技术成熟，相对容易获取，且表现出优越的机械性能，在维持良好生物相容性和可降解性基础上，显著提高生物材料的物理性能。PCL 具有较好的热塑性，与HA 复合可改善其物理性能。CHEN 等［19］通过静电纺丝技术制备PCL/HA 纳米纤维膜，并将Ag+纳米颗粒嵌入PCL/HA 纳米纤维膜中，制备出无细胞毒性的防粘连膜，可缓慢释放HA 和Ag+，起润滑肌腱和抗菌作用，而纳米纤维膜的微孔结构在肌腱愈合过程中也发挥了重要作用，可阻断成纤维细胞的附着和增殖，提高抗粘连能力。在众多优异性能的合成材料中，ε-聚赖氨酸属于碱性氨基酸聚合物，具有广谱抑菌性、良好的热稳定性和水溶性等特性，有学者将HA 和ε-聚赖氨酸复合制备出具有抗菌特性的新型防粘连凝胶，可特异性抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长，通过杀伤创口表面细菌，抑制炎症反应，加速伤口愈合［20］。Pluronic F127 是一种由聚氧化乙烯和聚丙烯氧化物组成的遇热凝胶共聚物。KIM 等［21］用HA、Pluronic F127 和γ-聚谷氨酸制备可注射的复合凝胶，通过增加聚γ-谷氨酸的分子质量和浓度，使其体外降解时间由3 d 延长至10 d，与术后粘连预防的关键时期相匹配。在动物实验中通过组织学分析和组织粘连分级结果证明了含聚γ-谷氨酸的Pluronic F127-HA 能明显减轻组织间粘连，且因Pluronic F127 的热敏溶胶—凝胶转变，使该凝胶在低温下具有可注射性，约37 ℃可迅速成胶，极大满足了临床对抗粘连产品可操作性的要求。

2.5 复合金属离子的HA 衍生物 HA 是带负电荷的聚阴离子电解质，极易与带正电荷的金属离子通过静电耦合到一起。和HA 相比，与金属阳离子结合形成的配合物往往具有不同的生物功能。通过将HA 与Zn2+耦合，可制备具有清除自由基、抗氧化及促伤口恢复等作用的络合物。AMANO 等［22］用亚 氨基二 乙 酸修饰 的HA 与Fe3+配合，得到一种具有良好生物相容性的可降解凝胶，在大鼠侧壁缺陷—肠道磨损模型中，该配合物在减少黏附形成方面的疗效比HA 更强。与金属离子配合，不仅提高了HA 的稳定性，延长其在体内的存留时间，而且可以在保持原有机械阻挡作用抗粘连的基础上，添加特定金属离子的作用特性，进而促进创伤组织愈合，减少组织间粘连形成。

3 HA 及其衍生物联合纳米技术在预防术后粘连中的应用

纳米材料是利用纳米技术对传统材料的结构进行改良而得到的一种新型材料，具有尺寸可调、低细胞毒性、良好生物理化性能及高孔隙率大表面积等优点；空间结构接近人体组织细胞外基质，对细胞的黏附、增殖及蛋白分泌具有重要作用，能够促进局部组织修复与再生，被广泛应用于医学生物学领域［23］。CHEN 等［24］以碳二亚胺作为耦联剂，将HA 共价接枝到PCL 纳米纤维膜上，制成PCL-HA 纳米纤维膜。通过体外细胞培养显示，该材料可降低成纤维细胞在膜表面的黏附能力，从而抑制粘连形成。与此同时，在动物实验中发现其能有效减少腱周粘连，并且预防腱周粘连的功效对比结果显示，PCL-HA 纳米纤维膜明显优于PCL 纳米纤维膜和Seprafilm。另一项研究［25］显示，将银纳米粒嵌入聚乳酸纳米纤维鞘中，再将HA 包埋在纳米纤维芯中，通过同轴电防丝制备具有多功能的芯鞘纳米纤维，通过改变结构及与新型聚合物结合，使其在不阻碍局部营养物质运输、吸收的前提下，不仅加强了原有的抗粘连功能，还引入了Ag+的抗菌性能，从而加速创伤的愈合。SHEU 等［26］制备了一种新型双交联电防透明质酸纳米纤维膜，具有良好的生物相容性，有利于细胞增殖、分化形成新的功能性组织，将这种纳米纤维膜放在受损的腹膜上，能显著降低腹膜与周围器官间纤维带的形成。目前全球纳米生物材料还处于开发研制阶段，还未达到规模生产，快速实现纳米生物材料产业化，有赖于各国加大对纳米技术应用研究的投入，这将是一个漫长的过程。

4 HA 及其衍生物负载细胞或生长因子在预防术后粘连中的应用

粘连形成是动态发生发展的过程，涉及多种细胞和生长因子，通过不同的信号通路调控伤口愈合过程中组织间黏附的形成。如何在维持外源细胞及各种细胞因子活性的基础上，延长其在受损组织表面的驻留时间困扰着大批研究者，而凝胶的可控性缓释是解决此难题的手段之一。其中，具有良好生物相容性的HA 凝胶是最常用的凝胶之一，能够吸附细胞及生长因子，促进细胞的增殖、迁移和分化，从而调控组织间粘连的形成。

4.1 HA 及其衍生物负载细胞 间充质干细胞是一类多功能细胞，起源于中胚层，具有自我更新和多向分化潜能，能在特定条件下分化成不同的细胞，在组织和器官修复中拥有巨大的潜能。WANG 等［27］将恒河猴通过机械损伤建立宫腔粘连模型，发现与单用HA 凝胶相比，HA 凝胶联合羊膜间充质干细胞（hAMSCs）可使促炎因子干扰素-γ表达水平降低，抗炎因子白介素4 和促进细胞增殖及组织修复的胰岛素样生长因子-1、表皮细胞生长因子表达上调。因此，推论HA凝胶除了通过发挥物理屏障作用预防宫腔粘连外，还可为hAMSCs提供生存微环境，并促进了hAMSCs 的增殖、分泌及其向子宫内膜细胞的分化，从而修复受损的子宫内膜，降低宫腔粘连的发生率。XU 等［28］通过在一种自交联透明质酸凝胶中加入脂肪间充质干细胞制成一种富含干细胞的复合凝胶，发现该复合物不仅可抑制宫腔粘连形成，还有助于改善子宫内膜的容受性。

4.2 HA 及其衍生物负载生长因子 越来越多的研究发现，生长因子对伤口愈合和组织修复具有积极作用。LIU 等［29］提取骨髓间充质干细胞，用无血清培养基培养72 h 后收集上清液，ELISA 检测发现上清液中含有多种生长因子，如表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1 和纤维母细胞生长因子等；实验中将上清液与交联HA 凝胶共培养，再将该复合物注入宫腔粘连的大鼠宫腔中，结果表明交联HA 凝胶可为生长因子创造一个安全、持续的缓释系统，以此修复受损的大鼠子宫内膜并提高妊娠率。WEI 等［30］发现，负载角化细胞生长因子（KGF）的HA 凝胶能抑制促炎因子的释放，促进腹膜间皮细胞增殖，参与腹膜修复的生理过程，并抑制粘连的形成。KGF/HA 凝胶虽然可以防止术后粘连的形成，然而其临床结果并不令人满意，因为它们在体内的生物活性弱。在另一项研究［31］中，通过自组装和聚合方法制备了聚多巴胺—角化细胞生长因子纳米颗粒，再将其与HA 结合制成复合物，可有效规避生物活性弱所带来的困扰；该材料不仅能减少胶原沉积和纤维化的发生，还能进一步抑制炎症反应，促进腹膜间皮细胞修复，表现出立竿见影的抗粘连效果，为临床提供了术后粘连预防的新方案。

5 HA 及其衍生物负载药物在预防术后粘连中的应用

HA 因有良好的生物相容性、可降解性以及与细胞表面受体特异性结合的特性，使其具备了作为药物载体的巨大潜质。此外，HA 还可以通过多种化学修饰方法构建药物前体或载体，能够明显延长药物有效成分在体液循环中的保留时间，提高创伤组织局部药物浓度和生物利用度，尽可能避免因给药剂量过大所致的不良反应。丝裂霉素C可诱导成纤维细胞凋亡，从而抑制粘连形成。ZHAO 等［32］利用静电纺丝法制成负载丝裂霉素C的HA-聚乳酸纤维膜，其在体外可持续释放丝裂霉素C 长达40 d，而且可调节成纤维细胞凋亡基因表达和胶原蛋白合成，在不影响肌腱愈合的情况下抑制粘连形成。LI 等［33］构建HA/聚乳酸/聚乙二醇仿生双层鞘膜模拟正常的生物组织，与非甾体抗炎药塞来昔布结合，该产品可不断释放塞来昔布以减弱炎症反应，还能润滑和促进组织修复，防止肌腱粘连。CHEN 等［34］使HA/布洛芬纳米纤维膜、FeCl3和1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联制成可控制释放布洛芬的纳米纤维膜，动物实验结果表明了负载布洛芬的纳米纤维膜是抑制炎症和减少肌腱粘连形成的理想物理屏障膜。以HA及其衍生物作为药物载体，不仅能加强抗粘连效果，还可促进创面组织愈合。

综上所述，HA 已经从一个简单的普遍存在于细胞外基质的多糖，演变成具有复杂生物学功能的大分子，在保持原有的可调节渗透压、形成物理屏障及调控细胞功能等优异生物特性前提下，通过化学改性、物理改性、复合改性、纳米技术等，提高了稳定性，延长了其在体内的驻留时间，有利于细胞的黏附、增殖及蛋白分泌，从而加速组织创伤修复过程，还兼具消炎、止血、促生长等作用，但其抗粘连的有效性和安全性还不足以满足人们的需求。近年来，经过科研人员的不断探索，发现HA及其衍生物还可为细胞、生长因子及药物提供适合的生存微环境及缓释系统，从而实现对特定细胞功能的调控，引导细胞定向增殖分化，促使组织达到生理性修复，显著减少组织间黏附形成，为术后粘连预防带来了新的希望。尽管各种不同的材料和技术已被研发，但目前尚未研制出一款安全、有效、作用机制明确的理想抗粘连产品。在细胞和分子方面，对粘连形成的具体机制仍然知之甚少，应加强对粘连形成具体机制的研究工作，以及使HA 及其衍生物能结合外源物质作用于粘连形成的关键靶点，这是现阶段HA 及其衍生物预防粘连的重点发展方向。相信随着对粘连机制的深入研究及对HA 相关产品性能的不断优化，其在术后粘连预防方面将发展至新的高度。