PMIC-92和NMIC-413对分离自住院患者标本的细菌药敏检测性能

梁正，范颖欣，聂署萍

1 中山大学附属第八医院检验科，广东 深圳 518033；2 广东省兴宁市第三人民医院检验科

近年来，细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战。细菌的药物敏感性测定能指导临床合理用药，避免抗生素的滥用，延缓耐药菌的产生［1-3］。细菌药敏试验的常规方法主要有肉汤稀释法、K-B 纸片扩散法、E-test 及自动化药敏分析系统。自动化药敏分析系统操作简单、易标准化，现已广泛应用于临床微生物实验室［4-10］。BD Phoenix 和VITEK 2 Compact 是目前应用最为广泛的全自动微生物分析系统［11-15］。革兰阳性细菌药敏板PMIC-92 和革兰阴性细菌药敏板NMIC-413是根据临床市场特征和病原菌流行病学现状而设计的两款新型药物敏感性检测试剂板。与其他商品化的药敏检测试剂相比，PMIC-92 和NMIC-413 药敏板增加了抗菌药物数量，如PMIC-92药敏板包括磷霉素、米诺环素、头孢洛林等，NMIC-413 药敏板包括磷霉素、替加环素、头孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素等，为临床抗感染药物的选择提供更多支持，进一步提高了临床微生物实验室细菌药物敏感性的检测能力。此外，这两种药敏板还依据细菌耐药监测数据对特定药物扩大了MIC 检测范围。目前，国内评估这两种药敏板检测性能的研究少见。本研究以实验室现有的VITEK 2 Compact 系统结合K-B 纸片扩散法作为参比方法，评估PMIC-92、NMIC-413 药敏板对临床菌株的药敏检测性能。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2018 年7—10 月中山大学附属第八医院微生物室从临床送检各类标本中分离的40 株临床株［革兰阳性菌17 株（葡萄球菌13 株、肠球菌4 株）、革兰阴性菌23 株（肠杆菌科细菌15株、非发酵菌8 株）］及4 株实验室保存的标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212）。标准菌株使用前通过甘油肉汤保存于-80 ℃环境中。复苏后每天检测3次，重复5 d，各测15 次。

1.2 主要仪器与试剂 BD Phoenix M50 全自动微生物鉴定药敏分析仪及其配套NMIC-413 阴性细菌药敏检测板和PMIC-92 阳性细菌药敏检测板。BD Phoenix 鉴定及药敏试验培养液，药敏指示剂（美国BD 公司）。Vitek 2 Compact 全自动微生物鉴定药敏分析仪、Vitek 2 Compact GN 和GP 鉴定卡、Vitek 2 Compact AST-GN13、AST-GN335 及ASTGP639 药敏卡（法国生物梅里埃公司）、药敏纸片（英国OXOID 公司）、血琼脂平板（安图）、MH 琼脂平板（凯林）、游标卡尺、比浊仪、涡旋仪。

1.3 细菌药敏检测 将菌株接种至含有5%羊血的血琼脂平板上，在35 ℃环境中孵育18～24 h。从平板上挑取单个菌落，传代1 次。然后分别按照BD Phoenix M50 及Vitek 2 Compact 全自动微生物鉴定药敏分析仪操作规程进行操作。对于部分Vitek 2 Compact 无法检测的药物，补充K-B 纸片扩散法检测。药敏结果参考CLSI2020 的折点报告其敏感（S）、中介（I）、耐药（R）结果，当结果出现重大差异（MD）和极重大差异（VMD）时，进行重复测定。①BD Phoenix M50 PMIC-92 和NMIC-413 药 敏检测：a.用无菌棉拭子，挑取单个菌落在鉴定肉汤管中，配置成0.50～0.60 麦氏浓度的菌液。b.取一只药敏肉汤管，加入45 µL 药敏指示剂，混匀。从鉴定肉汤管中吸取25 µL 菌悬液，加入药敏肉汤中。c.把含有菌液的药敏肉汤管倾倒入相应检测板的填充端口中，阳性球菌使用PMIC-92 检测板，阴性杆菌菌选择NMIC-413，让液体沿检测板轨道来回流动，然后再将检测板按照仪器操作流程上机检测。②Vitek 2 Compact AST-GN13、ASTGN335 及AST-GP639 药敏 检 测：a.将一次 性 塑料试管放置在载卡架上，每管中加入3 mL 的0.45%NaCl 溶液。b.用无菌棉拭子，挑取单个菌落在含NaCl 溶液的塑料试管中，配置成0.5～0.63 麦氏浓度的菌液。c.分别将145 µL（AST GN）或280 µL（AST GP）配制好的菌悬液加入新的含NaCl 溶液塑料试管中，做为药敏管。d.将相应药敏卡片的输样管插入到药敏管中，然后将载卡架加载至机器上进行检测。③K-B 纸片扩散法药敏检测：由于部分细菌—抗生素组合如肠杆菌科—头孢哌酮/舒巴坦及头孢呋辛，铜绿假单胞菌—氨曲南，鲍曼不动杆菌—阿米卡星及氨苄西林/舒巴坦等，通过Vitek 2 Compact 相应药敏卡无法获得准确的药敏试验结果，以上抗菌药物通过K-B纸片扩散法进行比对。具体步骤如下：a.用无菌棉拭子，挑取单个菌落在0.45%NaCl 溶液中，配置成0.5 麦氏浓度的菌液。b.接种：用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹接种3 次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1 周。c.贴抗菌药物纸片：平板置室温干燥3～5 min，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧贴在琼脂表面，各纸片中心相距＞24 mm，纸片距平板内缘＞15 mm。d.孵育：置35 ℃孵育16～18 h 后判读结果。e.结果判读：用游标卡尺测量抑菌圈直径（抑菌图的边缘应是无明显细菌生长的区域），测量时应将平板置于黑色背景下，肉眼判读；按照CLSI 2020 的折点对结果进行解释。

1.4 药敏结果分析 a.总分类一致性（CA）：研究产品与参比方法判断试验结果为敏感（S）、中介（I）、耐药（R），结果完全一致。b.小误差（MIE）：研究产品将中介判为S 或R，将R 或S 判为I。c.重大差异（MD）：研究产品结果为R，参比方法结果为S。d.极重大差异（VMD）：研究产品结果为S，参比方法结果为R。

2 结果

针对革兰阳性菌药敏板PMIC-92 共评估了14种抗菌药物，分别为青霉素（47 株）、苯唑西林（28株）、替考拉宁（47 株）、万古霉素（47 株）、利奈唑胺（47 株）、红霉素（47 株）、克林霉素（28 株）、替加环素（47 株）、左氧氟沙星（47 株）、莫西沙星（28 株）、庆大霉素（28 株）、达托霉素（47 株）、利福平（28 株）及复方磺胺甲噁唑（28 株）。产生MIE 的细菌—抗生素组合（株数）为：金黄色葡萄球菌—利福平（1 株），屎肠球菌—利奈唑胺（1株）。产生MD 的细菌—抗生素组合（株数）为：金黄色葡萄球菌—青霉素（1 株），金黄色葡萄球菌—庆大霉素（1 株），沃氏葡萄球菌—复方磺胺甲噁唑（1 株）。无极重大差异（VMD）的细菌—抗生素组合。PMIC-92 比对了14 种抗菌药物，在544株细菌—抗生素组合，总分类一致性（CA）为99.08%，小误差（MIE）率为0.37%，重大差异（MD）率为0.55%。此外，在13 株临床分离的葡萄球菌中，PMIC-92 检出耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）5 株，与Vitek 2 Compact AST-GP639 的符合率为100%。

针对革兰阴性菌药敏板NMIC-413 共评估了17 种药物，分别为头孢呋辛（28 株）、头孢曲松（29 株）、氨苄西林/舒巴坦（29 株）、哌拉西林/他唑巴坦（51 株）、头孢他啶（51 株）、头孢吡肟（51株）、头孢哌酮/舒巴坦（51 株）、氨曲南（49 株）、亚胺培南（51 株）、厄他培南（26 株）、美罗培南（21 株）、阿米卡星（49 株）、左氧氟沙星（51 株），环丙沙星（47 株）、复方磺胺甲噁唑（49 株），庆大霉素（29 株）、妥布霉素（19 株）。产生MIE 的细菌—抗生素组合（株数）为：大肠埃希菌—亚胺培南（1 株）、铜绿假单胞菌—美罗培南（1 株）、木糖氧化无色杆菌—头孢他定（1 株）、大肠埃希菌—头孢吡肟（1 株）、铜绿假单胞菌—氨曲南（1 株）、沙门菌属—环丙沙星（1 株）、大肠埃希菌—氨苄西林/舒巴坦（1 株）。产生MD 的细菌—抗生素组合（株数）为：大肠埃希菌—头孢吡肟（2 株）、大肠埃希菌—头孢哌酮/舒巴坦（1 株）、木糖氧化无色杆菌—头孢哌酮/舒巴坦（1 株）、铜绿假单胞菌—复方磺胺甲噁唑（1 株）、嗜麦芽窄食单胞菌—复方磺胺甲噁唑（1 株）、铜绿假单胞菌—亚胺培南（1 株）、大肠埃希菌—庆大霉素（1 株）。产生极重大差异VMD 的细菌—抗生素组合（株数）为：大肠埃希菌—氨苄西林/舒巴坦（1 株）。NMIC-413 共比对了17 种抗菌药物，在全部681 株细菌—抗生素组合中，总CA 为97.65%，MIE 率为1.03%，MD 率为1.17%，VMD 率为0.15%。在13株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床株中，NMIC-413 检 出10 株 产ESBL 细 菌，与Vitek 2 Compact AST-GN13 的符合率为100%。

3 讨论

近年来，由于抗菌药物的广泛使用，细菌耐药已成为全球公共卫生领域的重大挑战，严重威胁着人类健康［2-3］。快速、准确的药敏检测已成为临床抗感染治疗的迫切需求，不仅能指导临床合理用药，提高疗效，节省费用，还能进行耐药监测及流行病学调查，为抗菌药物的临床使用及管理提供依据。全自动微生物鉴定与药敏分析系统因其操作简单、快速、标准化的特点，越来越多地应用于临床微生物室［4-8］。BD Phoenix 是目前全球应用最为广泛的全自动微生物鉴定与药敏分析系统之一，其药敏试验采用比浊法和氧化还原法，报告实测最小抑菌浓度，结果准确可靠［16-18］。阳性菌药敏板PMIC-92 和阴性菌药敏板NMIC-413 是两款药物敏感性检测板，与其他商品化药敏检测试剂比较，PMIC-92 和NMIC-413 增加了抗菌药物数量，如在肠杆菌目细菌药敏检测中，阴性菌药敏板NMIC-413 与Vitek 2 Compact AST-GN13 相比增加了磷霉素、美罗培南、米诺环素、头孢呋辛、头孢西丁、莫西沙星、头孢哌酮/舒巴坦、多粘菌素等药物；PMIC-92 与VITEK 2 GP39 相比增加了替考拉宁、诺氟沙星、呋喃妥因等药物，为临床抗感染疾病的治疗提供更多选择。为评估其药敏检测性能，本研究将PMIC-92、NMIC-413 药敏板与实验室现有的Vitek 2 Compact系统进行比对，部分Vitek 2 Compact 无法准确检测的抗菌药物，则通过与K-B 纸片扩散法比较对其进行评估。

本研究选取的评估菌株包括4 株标准株和40 株临床分离株，临床分离株中17 株革兰阳性菌及23 株革兰阴性菌，可以代表大多数临床相关致病菌。针对革兰阳性菌药敏板PMIC-92 共评估了14 种抗菌药物，在544 株细菌—抗生素组合，总CA 为99.08%，MIE 率为0.37%，MD 率为0.55%，表明其药敏测定的准确性，对于部分细菌—抗生素药敏测定的MD＞3%，如金黄色葡萄球菌—庆大霉素，沃氏葡萄球菌—复方磺胺甲噁唑等，主要是由于本研究中针对该抗生素的菌株数量较少。此外，PMIC-92 成功检出5 株MRS，敏感性和特异性均为100%。

本研究针对革兰阴性菌药敏板NMIC-413 共评估了17 种药物，在全部681 株细菌—抗生素组合中，总CA 为97.65%，MIE 率为1.03%，MD 率为1.17%，VMD 率为0.15%。部分细菌—抗生素药敏测定的MD＞3%，如大肠埃希菌—头孢吡肟、大肠埃希菌—头孢哌酮/舒巴坦、木糖氧化无色杆菌—头孢哌酮/舒巴坦，嗜麦芽窄食单胞菌—复方磺胺甲噁唑，均是由于临床菌株数量不够导致，后续应加大菌株的数量，进一步验证这些抗生素的药敏试验测定性能。本研究中仅1 株大肠埃希菌—氨苄西林/舒巴坦出现了VMD。HONG 等［19］用825株临床分离株来评价NMIC-413 药敏测定性能，研究发现除了肠球菌—环丙沙星，不动杆菌属—头孢吡肟组合外，其他细菌—抗生素组合中CA 均超过90%，与本研究结果一致。此外，NMIC-413 还检测出10 株产ESBL 肠杆菌科细菌，与Vitek 2 Compact的符合率为100%。研究［20］评估了BD Phoenix NMIC-413 药敏板检测肠杆菌目细菌碳青霉烯类药物敏感性试验的性能，结果表明与微量肉汤稀释法及纸片法相比，BD Phoenix NMIC-413 药敏板能更可靠的检测碳青霉烯类耐药的肠杆菌目细菌。充分表明革兰阴性菌药敏板NMIC-413 能对临床常见的革兰阴性菌进行快速准确的药敏测定。

总之，药敏板PMIC-92 和NMIC-413 能分别对临床分离的革兰阳性菌和革兰阴性菌的药物敏感性进行快速、准确的测定，可应用于临床实验室进行药敏检测。