miR-145-5p通过TCTP调节胶质瘤细胞对DMC-BH的耐药性

程超, 孙关, 石磊

胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤[1]。GBM的特点是增殖快、侵袭性强、血管生成丰富、对放化疗均不敏感等。加上肿瘤的境界不清，往往无法做到全切[2-3]。替莫唑胺(TMZ)是目前抗胶质瘤的一线化疗药物，但它同样面临的一个问题是耐药，而耐药性是影响化疗疗效的主要因素[4]。先前的研究表明，耐药性是一个复杂的过程，涉及许多基因，包括微 RNA (microRNA, miRNA)[5]。

DMC-BH是双脱甲氧基姜黄素的衍生物，为本实验室开发的一个专利化合物，已证明其可有效地通过血脑屏障，对胶质母细胞瘤及其干细胞均有明显的抑制作用，并优于TMZ[6-7]。但DMC-BH同样存在耐药问题。研究报道miR-145在许多恶性肿瘤中高表达[8]。但与正常脑组织相比，miR-145 在神经胶质瘤细胞中呈低表达，并负向调节肿瘤发生；过表达 miR-145可显著降低胶质瘤体外增殖、迁移和侵袭[9]。近年来miR-145已越来越多地被确定为致癌作用和治疗耐药性的关键抑制因子[8]。Hua等[10]发现miR-145-5p 在神经胶质瘤细胞以及对替莫唑胺耐药的神经胶质瘤细胞中表达过低,过表达miR-145-5p 可抑制耐药的U251/TMZ细胞增殖。

在本实验中，我们分析了miR-145-5p在 U87/DMC-BH和U251/DMC-BH耐药细胞中的表达，观察其对 DMC-BH耐药细胞的细胞活性和耐药相关基因表达的影响，探讨miR-145-5p调节DMC-BH耐药的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

U87和U251细胞系购自中科院上海细胞库。 RIPA裂解液(KGP702)购自南京凯基生物科技有限公司。超敏ECL发光液(P0018AM)购自上海碧云天生物技术有限公司。TRIZOL购自美国Sigma-Aldrich公司。agomiR-145-5p (cat.miR40000437-4-5), agomir NC (cat.miR4N0000001-4-5), TCTP siRNA (siB11525134333-1-5) 和阴性对照(siRNAnc)购自广州市锐博生物科技有限公司。miDETECT A TrackTMmiRNAqPCR Kit(cat.C10711)、miDETECT A TrackTMUni-Reverse Primer、miDETECT A Track hsa-miR-145-5p Forward Primer(cat.miRA0000437-1-100)和miDETECT A TrackTMU6 Forward Primer(cat.miRAN0002)均购自广州市锐博生物科技有限公司。将翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的DNA编码序列扩增并亚克隆在pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)的BamHI和EcoRI位点之间，构建TCTP过表达载体(pcDNA3.1-TCTP)。TCTP、GAPDH抗体购自苏州锦博生物科技有限公司。MRP1、MDR1购自美国Abcam公司。高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 DMC-BH耐药细胞株构建 U87和U251细胞用含10% 胎牛血清(FBS )、100 U/ml 青霉素 G 和100 mg/ml 链霉素(Sigma-Aldrich，美国)的 DMEM 培养基中培养,置于 37 ℃ 、5%CO2孵箱。采用逐步增加DMC-BH浓度的方法诱导耐药细胞株。取对数生长的1×105/ml细胞悬液，加入起始浓度1 μmol/L DMC-BH培养24 h后，更换新鲜培养基继续培养15 d。消化传代后，再加入1倍浓度的 DMC-BH继续培养，直至DMC-BH浓度达到终浓度20 μmol/L。经过6个月左右时间建成DMC-BH耐药细胞株命名为U87/DMC-BH和U251/DMC-BH。

1.2.2 miR-145-5p细胞转染 将8×103个 U87或U251细胞种植于96孔板中，加入1 μl 20 μmol/L agomir，使局部浓度达到400 nmol/L，转染24～72 h后，荧光定量PCR检测miRNA的表达水平变化。TCTP siRNA和pcDNA3.1-TCTP转染：2×105个 U87或U251细胞种植于12孔板中，置于 37 ℃ 、5%CO2孵箱培养24 h后，利用Lipofectamine 3000按照1.5 μl∶1 μg DNA(v∶w)转染细胞。转染24～72 h后，Western blot 检测TCTP 蛋白表达。

1.2.3 荧光定量PCR检测 各组经处理的细胞利用TRIzol提取总 RNA。采用miDETECT A TrackTMmiRNAqPCR Kit分析miR-145-5p表达水平。1 μg总 RNA与miDETECT A TrackTMUni-RT Primer混合后，42 ℃反应1 h得到总cDNA，-20 ℃保存。将 2 μlcDNA与miDETECT A TrackTMUni-Reverse Primer和miDETECT A Track hsa-miR-145-5p Forward Primer混合。U6 Primer作为内参引物。扩增条件如下：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40个循环。使用 2-ΔΔCt方法计算比较阈值循环 (Ct) 值。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖 将3×103细胞/孔接种在 96 孔板中，并在 37 ℃、5%CO2的孵箱中培养24 h。然后转染miR-145-5p agomir、TCTP siRNA(si-TCTP)或pcDNA3.1-TCTP (p-TCTP)干预细胞指定时间后，每孔加入 10 μl CCK-8溶液，继续孵育4 h。随后，使用酶标仪(Sunrise，Tecan，澳大利亚)在 450 nm 处测量吸光度。

1.2.5 流式细胞检测细胞凋亡 各组经处理的细胞经不含EDTA的0.25%胰酶消化后，1 000 g 离心5 min。弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。然后，先后加入5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI染色液，轻轻混匀，室温20～25 ℃避光孵育10～20 min后，流式细胞仪检测。

1.2.6 Western blot检测 各组经处理的细胞利用RIPA裂解液提取总蛋白。总蛋白按照30 μg/泳道加入10%SDS-PAGE分离胶中在140 V恒压下电泳 50 min。之后，在300 mA 恒流下转膜60 min，将蛋白转移到 PVDF 膜上。在5%脱脂牛奶中封闭1 h后，将膜与以下一抗MRP1(1∶1 000)和MDR1(1∶1 000)孵育4 ℃过夜。TBST洗涤3次，每次5 min。之后，加入二抗(1∶2 000)继续孵育2 h。TBST洗涤3次，每次5 min。加入超敏ECL发光液显影。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-145-5p对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株增殖和凋亡的影响

荧光定量PCR分析miR-145-5p在DMC-BH耐药的胶质瘤细胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH和非耐药细胞株U87和U251之间的表达水平，见图1A。miR-145-5p在U87/DMC-BH中的表达水平是在U87中的32.3%，在U251/DMC-BH中的表达水平是在U251中的22.1%，miR-145-5p在U87/DMC-BH的表达水平低于U87，在U251/DMC-BH中表达水平低于在U251，差异均有统计学意义(P<0.05)。转染agomiR-145-5p后，荧光定量PCR检测示miR-145-5p在转染组细胞中的表达高于U87/DMC-BH和U251/DMC-BH组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1B。CCK-8提示U87/DMC-BH和U251/DMC-BH转染agomiR-145-5p后，24 h、48 h、72 h细胞的增殖活性下降，各时间点差异有统计学意义(P<0.05)。72 h时间点细胞存活率分别为agomir NC组的46.5%和38.4%，见图1C。流式细胞仪分析显示，agomiR-145-5p转染48 h后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞凋亡增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1D。Western blot检测提示，转染agomiR-145-5p后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞耐药相关蛋白MRP1和MDR1表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1E、1F。

1A：荧光定量PCR分析miR-145-5p在DMC-BH耐药胶质瘤细胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中的表达低于非耐药细胞株U87和U251(**P<0.05)；1B：荧光定量PCR检测细胞转染agomiR-145-5p后，miR-145-5p表达水平上升(**P<0.05)；1C：CCK-8检测示U87/DMC-BH和U251/DMC-BH转染agomiR-145-5p后，24 h、48 h、72 h细胞的增殖活性下降(**P<0.05)；1D：流式细胞仪检测，agomiR-145-5p转染后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞凋亡增加(**P<0.05)；1E：Western blot检测，转染agomiR-145-5p后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞耐药相关蛋白MRP1表达下降(**P<0.05)；1F：Western blot检测染agomiR-145-5p后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞耐药相关蛋白MDR1蛋白表达下降(**P<0.05)图1 miR-145-5p过表达对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株增殖和凋亡的作用

2.2 miR-145-5p调节DMC-BH耐药胶质瘤细胞株中TCTP表达

Western blot检测耐药胶质瘤细胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中TCTP蛋白的表达水平高于非耐药细胞株U87和U251，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A。而利用agomiR-145-5p转染增加miR-145-5p表达后，耐药细胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中的TCTP蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2B。

2A：Western blot检测TCTP蛋白在U87、U87/DMC-BH、U251和U251/DMC-BH中的表达水平，耐药胶质瘤细胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中TCTP蛋白的表达水平高于非耐药细胞株U87和U251(**P<0.05)；2B：Western blot检测上调miR-145-5p后，耐药细胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中的TCTP蛋白表达下降(**P<0.05)图2 miR-145-5p调节DMC-BH耐药胶质瘤细胞株中TCTP表达

2.3 下调TCTP对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株增殖和凋亡的影响

Western blot验证，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH转染TCTP siRNA后，耐药细胞株中的TCTP蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3A。进一步增殖实验分析转染72 h后，CCK-8提示TCTP siRNA组细胞的增殖活性较对照组(siRNAnc)下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3B。流式细胞仪分析，TCTP siRNA转染后，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞凋亡增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3C。

3A：U87/DMC-BH和U251/DMC-BH转染TCTP siRNA后，耐药细胞株中的TCTP蛋白表达下降(**P<0.05)；3B：CCK-8提示，TCTP siRNA转染后，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞的增殖活性下降(**P<0.05)；3C：流式细胞仪分析，TCTP siRNA转染后，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞凋亡增加(**P<0.05)图3 TCTP siRNA对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株活性的影响

2.4 共转染TCTP过表达载体(pcDNA3.1-TCTP)和agomiR-145-5p对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株增殖和凋亡的影响

共转染TCTP过表达载体(pcDNA3.1-TCTP)和agomiR-145-5p后，耐药细胞株中TCTP的表达较单独转染agomiR-145-5p增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4A；agomiR-145-5p转染造成的细胞增殖抑制和凋亡增加也得到了恢复，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4B、4C；耐药基因MRP1和MDR1的相应蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4D、4E。

4A：共转染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后，耐药细胞株中TCTP的表达较单独转染agomiR-145-5p增高(**P<0.05)；4B：共转染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后， U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞增殖较单独转染agomiR-145-5p细胞增加(**P<0.05)；4C：共转染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后， U87/DMC-BH和U251/DMC-BH细胞凋亡较单独转染agomiR-145-5p减少(**P<0.05)；4D：共转染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后，MRP1蛋白表达较单独转染agomiR-145-5p增加(**P<0.05)；4E：共转染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后，MDR1蛋白表达较单独转染agomiR-145-5p增加(**P<0.05)图4 共转染TCTP过表达载体(pcDNA3.1-TCTP)和agomiR-145-5p对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株增殖和凋亡的影响

3 讨论

胶质母细胞瘤对放化疗均不敏感，耐药是胶质瘤母细胞化疗失败的最主要因素。目前认为化疗药物耐药性的机制主要包括药物失活、肿瘤细胞药物外排、损伤修复、激活促生存信号通路和抑制细胞死亡通路等。但具体到每一种药物及每种肿瘤细胞其机制并不一致。

DMC-BH是通过对天然化合物DMC结构改良得到的一种化合物，表现出与临床一线药物TMZ相似的体内抗胶质瘤效应[6-7]。但长期长时间使用 DMC-BH仍然会导致耐药性的产生，并不能使原位移植瘤消失[7]。因此，理解胶质瘤细胞对DMC-BH耐药的产生机制有助于进一步破解其耐药性，提高 DMC-BH抗胶质瘤疗效，进一步有助于发现克服耐药的一些新的分子靶向治疗手段。

miR-145-5p首次在纤维肌痛患者中被报道，与健康对照组相比，miR-145-5p在纤维肌痛患者中的表达水平显著降低，并与纤维肌痛患者疼痛和疲劳有关[11]。近年来研究报道 miR-145-5p在结肠癌、肝癌、乳腺癌等包括胶质瘤在内的多种肿瘤组织中表达异常[12-15]。Zhang等[16]研究发现与Ⅰ/Ⅱ级胶质瘤患者和健康对照组相比，GBM患者的血清miR-145-5p水平显著降低；而血清miR-145-5p降低是GBM一个有效的诊断和预后生物标志物。同样，与对照组相比，miR-145-5p在胶质瘤组织和细胞中也显著下调[17]，而抑制miR-145-5p可促进胶质瘤细胞恶性进程[18]，但miR-145-5p在调节胶质瘤化疗耐药性方面研究仍然知之甚少。

在本研究中，我们发现miR-145-5p在增强胶质瘤细胞对DMC-BH的敏感性方面起着重要作用。miR-145-5p参与调节DMC-BH的化疗耐药性。miR-145-5p在DMC-BH耐药的胶质瘤细胞株中表达较非耐药株更低。而通过外源性转染上调miR-145-5p表达后，耐药的胶质瘤细胞株出现增殖活性下降，细胞凋亡增加。先前研究者发现miR-145调控胶质瘤干细胞迁移和侵袭的功能是通过其靶向ABCG2 mRNA介导的[19]。ABCG2是一种ATP结合盒转运蛋白，在GSC和更高级别的胶质瘤组织中过度表达。ABCG2的过度表达被认为是限制各种化合物在细胞内积累的重要机制之一。ABCG2具有广泛的底物谱，包括各种抗癌药物和环境致癌物，其功能与多药耐药(MDR)和肿瘤发展有关。在本研究中我们发现miR-145-5p可能是通过调节TCTP蛋白表达实现的。TCTP蛋白在耐药细胞株中呈高表达。而过表达miR-145-5p表达后耐药细胞株中的TCTP蛋白表达出现下降。利用小干涉RNA沉默TCTP后，耐药细胞株细胞也出现明显的增殖活性下降和凋亡增加。过表达TCTP表达后，miR-145-5p对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株增殖和凋亡的作用出现了逆转。这些证据表达miR-145-5p通过调节TCTP表达实现了对DMC-BH耐药胶质瘤细胞株耐药性调节。

综上所述， miR-145-5p可增强胶质瘤细胞株对DMC-BH耐药的敏感性，而这种作用是通过靶向调节TCTP实现的。