循环肿瘤细胞与尿路上皮癌患者临床特征之间的关系

刘杰， 马彩玲， 李小航， 李安安， 刘昕， 王志勇

尿路上皮癌是泌尿系统常见恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，我国尿路上皮癌的发病率为5.5/10万～5.8/10万，其中，上尿路尿路上皮癌首次确诊就发生肌层浸润的患者占比66.7%[1-2]。早期尿路上皮癌患者临床症状无特异性，影像学诊断率不高，缺乏有效的评价指标[3]。肿瘤远处转移最主要的方式之一是血行播散，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是实体恶性肿瘤原发灶或转移灶由于自发或者外科操作从而进入血液循环系统中所有肿瘤细胞的统称[4]。目前大量文献已证实CTC与多种癌症的诊断密切相关，包括胃癌[5]、前列腺癌[6]以及乳腺癌[7]。本研究采用阴性富集联合免疫荧光原位杂交技术(subtraction enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization，SE-iFISH)检测尿路上皮癌患者外周静脉血的CTC，并分析其与尿路上皮癌临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2018年8月至2019年10月就诊于承德医学院附属医院泌尿外科经组织病理证实为尿路上皮癌者为研究对象，纳入标准: ①年龄>18岁;②组织病理学诊断尿路上皮癌；③肿瘤无远处转移。排除标准：①患者依从性差；②影像学检查合并其他原发肿瘤。共105例患者入组尿路上皮癌组，其中首次在本中心就诊且病理证实为尿路上皮癌者为首次确诊组，共80例，其余的25例是治疗后复查时发现尿路上皮癌复发，为复发组。另选择同期30例良性尿路疾病患者为良性病变组，纳入标准：①病理诊断为良性病变(尿路上皮纤维息肉、膀胱炎、结石)；②既往无肿瘤病史。本研究获得了承德医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 静脉血采集 根据参考文献[8]，以7.5 ml外周静脉血CTC 数目≥1定义为 CTC 阳性。由经受过专业培训的护士于手术前1周采集尿路上皮癌患者和疑似尿路上皮癌病变者的肘正中静脉血7.5 ml，均存放于BD抗凝管中，20～30 ℃室温下避光保存，48 h内完成检测。

1.2.2 主要仪器和试剂 主要仪器：离心机、磁力架、杂交仪(Thermo S500-24)微型振荡混悬器(东林昌盛DL-SC05)、微型掌上离心机(东林昌盛DL-300)、微型台式真空泵(Qilinbeier GL-802B)。主要试剂盒:釆用iFISH CTC Identification Kit(赛特生物医药科技公司)试剂盒对已富集人外周血CTC并液染的载玻片进行原位杂交及DAPI荧光染色。

1.2.3 SE-iFISH检测流程 CTC富集流程：取BD抗凝管(7.5 ml外周静脉血)至离心机中。补充Cytelligen细胞分离液于样本中。加缓冲液Magnetic Beads Buffer，放置于磁力架下，磁场作用下吸取结合了磁珠的白细胞沉淀，而后转移到清洗液1×CRC离心管中离心并洗涤CTC细胞，可得到富含CTC的细胞悬液，汲取细胞悬液进行固定、干燥、封片。

1.3 瘤标iFISH CTC原位杂交及荧光染色

将载玻片置于32 ℃干燥箱内，4 h后加入清洗液1×CRC配平，颠倒混匀。650 g，1763 rmp离心5 min后，弃上清至100 μl。使用无水乙醇洗涤标本脱水。于标本框中央滴加10 μl CEP8，盖上盖玻片。立刻放入杂交仪，76 ℃变性10 min，37 ℃杂交4 h。取出标本片，移除盖玻片。每张玻片依次加入抗1 μl CD45抗体、1 μl CD31抗体室温下孵育，最后滴加5 μl DAPI细胞核染色液、标记染色。荧光镜下判读CTC，CTC阳性判定标准：DAPI+、CD45-、CD31-、CEP8+≥3倍体，见图1，定义CTC数目≥1为阳性。

图1 荧光镜下CTC阳性示意图(图中为DAPI+、CD45-、CD31-、CEP8+的5倍体,免疫荧光染色 ×40)

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。分析CTC与尿路上皮癌组和尿路上皮癌首次确诊组患者临床特征之间的关系；肿瘤T分期与CTC数目之间的关联采用Kruskal-WallisH检验和Spearman相关性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者外周血中CTC的检测结果

105例尿路上皮癌患者血液标本无明显溶血、凝血，满足SE-iFISH Circulating Tumor Cell Kit检测的质量要求，标本合格率为100%。SE-iFISH系统检测结果显示,105例尿路上皮癌组中CTC阳性率为76.19%(80/105)；CTC检出的中位数5(1～34)个；首次确诊组中CTC阳性率为75.00%(60/80)，CTC检出的中位数为3(1～19)个；25例尿路上皮癌复发组患者中CTC阳性率为80.00%(20/25)，CTC检出的中位数为3(0～20)个；良性病变组中CTC阳性率为10.00%(3/30)，CTC检出的中位数为0(0～6)个。尿路上皮癌组与良性病变组之间的差异有统计学意义(χ2=43.167，P<0.001)。而首次确诊组与复发组之间的差异无统计学意义(χ2=0.262，P=0.608)。

2.2 尿路上皮癌患者CTC与临床特征之间的关系

由表1可见，尿路上皮癌CTC阳性率在肿瘤分化程度、浸润程度、病灶数、肿瘤最大径、肿瘤T分期组间，差异有统计学意义(P<0.05), 而在年龄、性别、血尿、复发、病理类型组间，差异无统计学意义(P>0.05) 。

表1 尿路上皮癌患者CTC阳性率与临床特征的关系[例(%)]

2.3 尿路上皮癌首次确诊组患者CTC与临床特征之间的关系

由表2可见，尿路上皮癌首次确诊患者CTC阳性率在肿瘤分化程度、浸润程度、病灶数、肿瘤最大径、肿瘤T分期组间，差异有统计学意义 (P<0.05), 而在年龄、性别、血尿、病理类型组间，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 尿路上皮癌首次确诊组CTC阳性率与临床特征的关系[例(%)]

2.4 CTC数目与尿路上皮癌T分期的关系

尿路上皮癌患者中CTC的检出率：T1期17/32(53.12%)，T2期29/37(78.38%)，T3期 18/20(90.00%)，T4期16/16(100.00%)。CTC的检出数目：T1期2.38(0～12)个，T2期4.65(0～17)个, T3期9.60(0～26)个，T4期12.00(4～34)个。Kruskal-Wallis检验结果显示，外周血中CTC水平与肿瘤T分期有关，差异有统计学意义(H=29.083，P<0.001)。进一步用Spearman分析CTC数目和肿瘤T分期之间的相关性，结果显示， CTC计数和肿瘤T分期呈正相关(r=0.526，P<0.001)。见图2。

注：○为样本数据中的极端值，已剔除图2 CTC计数与肿瘤T分期之间的关系

3 讨论

尿路上皮癌的常规检测手段有尿液细胞学、影像学、病理活检以及膀胱镜检查，然而它们或灵敏度低，或操作后易出现尿路感染、尿路种植性转移等并发症[3，11]。澳大利亚Ashworth等[12]首次在1例死亡患者外周血中发现类似于肿瘤的细胞，提出了CTC的概念。随着学者对肿瘤转移机制认识的不断提升以及检测技术的进步，CTC已成为肿瘤研究的热点。

目前，大多数富集技术主要是基于CTC的物理特性(癌细胞的直径、密度和表面粗糙黏附力)或生物特性(癌细胞表面特异性标志物或基因表达)[13]。本研究采用SE-iFISH检测尿路上皮癌患者的CTC，结果显示阳性率高达76.19%，高于良性病变组患者(为10%)，说明SE-iFISH检测技术有助于尿路上皮癌的诊断。可能原因有：①该技术采用的阴性富集法能有效去除非肿瘤细胞成分。②对于经历上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的CTC或者间质来源的CTC可以高效地富集，而这一特点是阳性富集系统所不具备的[8，14]。

Tanaka等[15]运用CellSearch System检测技术，回顾性分析125例肺癌患者CTC的检出率及数目情况，得出CTC阳性率及数目可以精准地区分肿瘤分期的结论。李慧等[8]发现各期非小细胞肺癌患者血液中均有CTC，其中T4期患者的CTC阳性率最高。此外，早期的非小细胞肺癌患者虽未能在影像学中发现转移灶，但CTC呈阳性，提示肿瘤可能已发生微转移。Yu等[16]首次报道了CTC与晚期结直肠癌患者的检出率相关。本研究发现，在早期(T1期)尿路上皮癌患者中CTC的阳性率为53.13%，推测在尿路上皮癌的早期已发生了远处微转移。此外，本研究还发现肿瘤CTC数目和T分期呈现正相关，肿瘤T分期越高的患者，其外周血中CTC数目越多。这提示我们肿瘤的恶性程度可能与CTC数目紧密相关，未来如果将临床肿瘤T分期和CTC检测的结果进行综合分析，可能有效地发现高风险患者，通过缩短对这部分患者的随访和检查的时间，能及时发现早期肿瘤微转移灶以及病情的进展，并为患者的治疗方案提供新的重要依据。

有关CTC与尿路上皮癌患者临床特征之间的关系，目前的研究仍存在一定争议。有研究报道CTC阳性率与肌层浸润程度密切相关，而与肿瘤直径、切缘阳性以及淋巴结转移均无相关性[17]。白云金等[18]采用流式细胞术检测78例膀胱癌患者，研究证实CTC阳性率与肿瘤直径、数目以及病理分级有关，而与肾积水、吸烟史不相关， Logistic多因素分析显示CTC与T分期、病理分级和肿瘤直径具有相关性。Koch等[19]研究显示CTC检出与微血管侵犯、切缘阳性、术后辅助化疗密切相关，而与肿瘤病理分期、病理分化程度、淋巴结转移无明显相关性。本研究发现CTC阳性在肿瘤分化程度、肿瘤浸润程度、肿瘤最大径、肿瘤T分期组间，差异均有统计学意义，研究结果的差异可能与纳入研究对象不足以及CTC检测手段不同有关。由于尿路上皮癌患者术后大多数会进行膀胱灌注化疗，不能排除膀胱灌注化疗对CTC的影响，为了进一步探究膀胱灌注化疗对血液中CTC的影响，本研究分别设置尿路上皮癌首次确诊组和尿路上皮癌组，分别分析了两组患者与临床特征的统计学关系，结果显示两组的结果一致。此外，本文还分析了首次确诊组与复发组之间CTC检出率的差异，结果显示差异无统计学意义。考虑可能原因有：膀胱灌注化疗药物仅直接作用于种植尿路上皮表面肿瘤细胞或切缘的肿瘤,并不入血影响血液中CTC数目;本研究纳入的复发尿路上皮癌患者较少。

本研究样本量较少，仅对患者的临床特征进行统计学分析，而CTC与尿路上皮癌患者的无进展生存期及总生存期之间的联系有待我们进一步研究证实。本研究课题组将扩大样本、多次监测CTC的动态变化、长时间随访，让CTC检测技术在尿路上皮癌患者的综合治疗中更好发挥作用。