低盐对棕点石斑鱼幼鱼渗透压调节、Na+／K+-ATPase活性及相关基因表达的影响

刘龙龙，罗 鸣，陈傅晓，刘金叶

（1.海南热带海洋学院，热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室，三亚 572022；2.海南省海洋与渔业科学院，海口 571126）

盐度是影响鱼类生长、发育和繁殖的重要环境因子［1］。广盐性硬骨鱼可以通过有效的渗透压调节维持体内内环境的稳定，以适应生活环境中盐度的改变［2］。鱼类的渗透压调节作用是由一系列器官协同完成的，包括鳃、肠和肾［3］。鳃是鱼类主要的渗透压调节器官，位于鳃上皮富含线粒体的泌氯细胞是负责离子吸收和分泌的主要场所［4］。Na+／K+-ATPase是一种跨膜蛋白，是维持Na+和K+梯度的关键转运酶，在离子交换和渗透压调节中起着至关重要的作用［5］。Na+／K+-ATPase由两个亚基（α和β）组成，它们非共价配对形成αβ-异源二聚体。在硬骨鱼中发现了3种α亚型（α1、α2和α3）和4种β亚型（β1、β2、β3、β4）［6-7］，Na+／K+-ATPase活性不仅受物种不同和栖息地环境差异的影响，还受到α、β亚型组成比例转换调节的影响［8］，关于不同的α及β亚型对Na+／K+-ATPase活性的影响在不同硬骨鱼研究中存在争议［3］。

棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）又称为褐点石斑鱼，俗称老虎斑，隶属硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），鲈亚目（Percoidei），鮨 科（Serranidae），石斑鱼亚科（Epinephelinae），石斑鱼属。由于其肉味鲜美、生长快、市场潜力大，养殖前景较好，近年来已经成为福建、广东、海南等地海水养殖的重要名优品种。棕点石斑鱼对盐度耐受范围大，在盐度11‰～41‰水域都能生存，因此在不同盐度水域都开展了养殖［9］。对棕点石斑鱼的现有研究主要集中在生长繁育［10］、饲料营养［11-14］、养殖技术［15-16］、病害防治［17-18］等方面，关于盐度对棕点石斑鱼影响的研究相对较少，主要涉及盐度的耐受性［9］、在盐度22‰～28‰范围内生长情况［19］及在不同盐度下血清皮质醇水平及存活率［20］，关于低盐环境下棕点石斑鱼渗透压调节机制尚未见报道。本研究通过测定棕点石斑鱼在低盐条件下血清渗透压及离子水平、鳃Na+／K+-ATPase活性及相关基因表达、鳃组织学、耗氧率的影响，探讨其在低盐环境下的渗透压调节机制，以期为棕点石斑鱼在不同盐度水体中养殖研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用棕点石斑鱼幼鱼在海南省海洋与渔业科学院琼海科研基地孵化并养殖，试验鱼幼鱼体质量（56.8±3.5）g。暂养在体积为800 L的玻璃钢圆筒内，养殖期间水温（27.5±0.5）℃、养殖水体pH（8.0±0.1）、盐度（32±1）‰，实验期间连续充气，每天投喂人工配合饲料1次，投料1 h后吸净养殖容器底部残饵并接近全量换水。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

实验在琼海科研基地室内进行，养殖容器与暂养期间一致，不同处理盐度海水采用过滤后自来水稀释自然海水配制而成。实验设置盐度6‰、12‰、24‰、32‰ 4个梯度，每个梯度设3个重复，每个重复10尾鱼，实验时将棕点石斑鱼从自然海水（盐度32‰）直接转移到调整好的盐度为6‰、12‰、24‰、32‰（对照）圆桶中。根据前期研究，与棕点石斑鱼幼鱼适应养殖环境盐度变化相关的组织结构、生化和生理反应预计在迁移到新的盐度条件后的10 d内已经发生［21-22］，故实验共进行10 d。在实验结束后测定耗氧率。每组随机抽取3尾鱼，用丁香酚麻醉，尾静脉取血，4℃下静置分层后，再经冷冻离心机（4℃）6 000 r·min-1离心20 min，取无溶血血清用于测量血清渗透压及离子浓度；同时取各盐度组幼鱼左侧第二鳃弓上的0.1 g鳃丝经生理盐水润洗后置于2 mL冻存管经液氮速冻后转入-80℃冰箱保存，用于测定鳃 Na+／K+-ATPase活性及NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3基因的表达。另取盐度6‰、12‰、32‰组幼鱼右侧第二鳃弓中间部位腮丝用中性组织固定液（4%多聚甲醛，PB缓冲液）固定，用于鳃丝组织切片观察；取鱼体躯干部肌肉组织，剔除鱼骨、鱼皮，用纸巾擦净肌肉上的水和血，用于测量鱼体肌肉含水量。

1.2.2 海水和鱼血清渗透压及离子浓度

实验鱼血清和海水渗透压采用全自动组织渗透压仪（Osmo210，德国）测定，血清Na+、Cl-、K+离子浓度采用全自动生化分析仪（Chemray 240，中国）测定。

1.2.3 肌肉含水量的测定

肌肉含水量的测定先称取肌肉组织鲜重，再通过鼓风干燥箱（DHG-9076A，中国）100℃下连续烘烤48 h后称取肌肉组织干重，计算获得。

1.2.4 鳃Na+／K+-ATPase活性测定

鳃Na+／K+-ATPase活性采用南京建成生物工程研究所超微量Na+／K+-ATPase试剂盒测定。称取实验鱼鳃丝样品0.1 g加入9倍体积生理盐水，冰浴条件下匀浆，4℃离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液，按照试剂盒说明书方法测定鳃 Na+／K+-ATPase活 性（超微量 Na+／K+-ATPase试剂盒，南京建成）。

1.2.5 总RNA提取及实时荧光定量PCR检测

用总RNA抽提试剂盒（Invitrogen，美国）根据Trizol法从鳃组织提取总RNA，用紫外分光光度计检测样品核酸质量，用1.5%变性琼脂糖胶测定RNA质量和产率。用无RNA脱氧核糖核酸酶处理RNA（Takara，日本），逆转录合成cDNA第一链作为基因表达分析模板（Takara，日本）。以β-actin为内参基因进行棕点石斑鱼鳃组织NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3基因的实时定量RT-PCR测定（ABI StepOne PULS，美国），扩增体系体积为20 μL，其中包含10 μL的SybrGreen qPCR Master Mix、0.8μL引物（10 μmol· L-1）、7.2μL的无核酸酶水和2μL的cDNA模板。实时定量RT-PCR的反应程序如下：95℃3 min，然后95℃5 s，60℃30 s，共45个循环，在最后一个PCR循环结束时制作溶解曲线，确认产物的特异性。棕点石斑鱼NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3和内参β-actin引物根据转录组序列用Primer Premier 5.0设计并验证（表1）。用5个不同稀释度（每个稀释度3个重复）的cDNA样品绘制标准曲线，并根据E＝10（-1／slope）-1分析扩增效率，确保扩增效率在0.9～1.1之间。获得CT值后代入2-ΔΔCT公式计算基因的相对表达量。

表1 基因NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3和内参β-actin基因qPCR引物序列Tab.1 Primers of NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3 and internal reference geneβ-actin in quantitative PCR

1.2.6 泌氯细胞数量和长径

将用中性组织固定液固定的鳃组织样品进行酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片（厚度4μm）、H.E染色、扫描（Pannoramic MIDI扫描仪，匈牙利）。用CaseViewer图像分析软件（3DHISTECH Ltd.）分别统计盐度6‰、12‰、32‰组试验鱼泌氯细胞数量和长径。泌氯细胞的计数参考UCHIDA［23］及赵峰等［24］方法，随机选取鳃丝（包含鳃小叶基部）和鳃小叶各6个部位，统计每100 μm鳃丝或鳃小叶上的泌氯细胞个数。

1.2.7 耗氧率的测定

测定前将鱼禁食12 h以上确保鱼活动减少，实验设置对照组用于计算不放鱼时的耗氧率变化值，将各圆桶水面用透明塑料薄膜覆盖封闭，分别测定初始和3 h后溶解氧浓度（In-Situ SMARTROLL MP便携式多参数监测仪，美国），耗氧率的计算公式为：RO＝（Oi-Ot-Ob）V／（m·t），式中，RO为耗氧率［mg·g-1·h-1］；Oi、Ot分别为初始、t时溶解氧含量（mg·L-1）；Ob为空白组溶解氧含量变化值（mg·L-1）；V是实验水体体积（L）；m是鱼体质量（g）；t为测量值之间的时间间隔（h）。

1.3 统计方法

数据以平均值±标准差（means±SD）形式表示。统计前对数据进行正态检验和方差同质性检验，用SPSS 19.0进行单因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan多重比较进行检测，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同盐度下棕点石斑鱼血清渗透压、血清离子浓度及肌肉含水量的比较

经过10 d的低盐适应，各盐度组棕点石斑鱼血清渗透压、血清Na+、Cl-、K+浓度及肌肉含水量如图1所示。随盐度的降低，棕点石斑鱼血清渗透压呈降低趋势，其中盐度6‰组血清渗透压显著低于其他组（P＜0.05）；血清Na+和K+浓度随盐度降低有降低趋势，其中盐度6‰组Na+、K+浓度显著低于对照组（P＜0.05）；各组间血清Cl-浓度无显著性差异（P＞0.05）；肌肉含水量随盐度的降低有上升趋势，但各组间无显著性差异（P＞0.05）。

图1 不同盐度下棕点石斑鱼幼鱼血清渗透压（A）、血清Na+、Cl-浓度（B）、血清K+浓度（C）、肌肉含水量（D）Fig.1 Serum osmolality（A），serum Na+and Cl-（B），serum K+（C），muscle water content（D）of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

线性回归分析表明（图2），血清渗透压与环境水渗透压呈线性相关（R2＝0.82，P＜0.05），回归直线与等渗线交点为等渗点渗透压343.73 mOsm·kg-1，所对应海水盐度为12.59‰。

图2 棕点石斑鱼幼鱼在不同盐度下血清渗透压和环境渗透压的关系Fig.2 Relationship between ambient water osmolality and serum osmolality of juvenile Epinephelus fuscoguttatus

2.2 不同盐度下棕点石斑鱼的Na+／K+-ATPase活性

经10 d低盐适应，棕点石斑鱼鳃Na+／K+-ATPase活性如图3所示，随着盐度的降低，鳃Na+／K+-ATPase活性先降低后上升，其中盐度12‰组活性最低，显著低于其他组（P＜0.05）。

图3 不同盐度下棕点石斑鱼幼鱼鳃Na+／K+-ATPase活性Fig.3 Gill Na+／K+-ATPase activity of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

2.3 不同盐度下棕点石斑鱼的NKA基因表达

盐度对鳃NKA基因表达影响如图4所示，经过10 d低盐的适应，随盐度的降低NKAα1基因表达量无显著变化（P＞0.05）。NKAβ1b基因表达量随盐度的降低先降低后升高；盐度12‰组基因表达量最低，显著低于其他盐度组（P＜0.05）；盐度6‰组显著低于24‰、32‰组（P＜0.05）。NKAα2a基因表达量随盐度的降低先升高后降低，盐度12‰基因表达量最高且显著高于其他盐度组（P＜0.05）；盐度6‰、24‰与对照组无显著性差异（P＞0.05）。NKAα3基因表达量随盐度的降低而降低，其中盐度6‰组最低且显著低于其他盐度组（P＜0.05），盐度32‰组最高且显著高于其他组（P＜0.05）。

图4 不同盐度下棕点石斑鱼幼鱼鳃NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3基因表达Fig.4 Expressions of NKAα1，NKAβ1b，NKAα2a，NKAα3 genes in gill of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

2.4 不同盐度下棕点石斑鱼泌氯细胞数量与长径

如图5所示，各盐度组棕点石斑鱼泌氯细胞在鳃丝及鳃小叶均有分布且主要分布在鳃丝及鳃小叶基部。不同盐度组鳃组织泌氯细胞数量与长径如图6所示，随盐度的降低，鳃丝泌氯细胞数量先减少后增加，在盐度12‰时最少，且显著低于盐度6‰、32‰组（P＜0.05）；鳃小叶泌氯细胞数量在盐度32‰时最多且显著高于盐度6‰组、12‰组（P＜0.05）。各盐度组鳃丝、鳃小叶泌氯细胞长径无显著差异（P＞0.05）。

图5 不同盐度下棕点石斑鱼幼鱼鳃泌氯细胞（箭头）Fig.5 Gill chloride cells（arrows）of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

图6 不同盐度下棕点石斑鱼幼鱼鳃丝、鳃小叶泌氯细胞数量及长径Fig.6 Number and diameter of chloride cells in filaments and lamellae of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

2.5 不同盐度下棕点石斑鱼的耗氧率

不同盐度组棕点石斑鱼的耗氧率如图7所示。经过10 d的低盐驯化，盐度的降低导致棕点石斑鱼耗氧率呈上升趋势，在盐度32‰时最低，且显著低于6‰组、24‰组（P＜0.05）；盐度6‰组、12‰组、24‰组之间耗氧率无显著性差异（P＞0.05）。

图7 不同盐度下棕点石斑鱼的耗氧率Fig.7 Oxygen consumption rate of Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

3 讨论

3.1 盐度对棕点石斑鱼血清渗透压调节的影响

当机体处于低渗或高渗环境时，血浆内环境与外界水环境之间存在一定的渗透压差，机体通过调节离子平衡来维持体内渗透压的稳定［25］。不同广盐性硬骨鱼的肌肉含水量通常在环境盐度的耐受范围内发生较小变化，黑鲷（Mylio macrocephalus）从海水转移到淡水后肌肉含水量增加［26］，青鳉（Oryzias latipes）从淡水转移到海水后肌肉含水量暂时下降，并在适应7 d后恢复［27］。本研究中棕点石斑鱼经过10 d的适应，各盐度组肌肉含水量并无显著性差异，这表明在6‰～32‰盐度条件下棕点石斑鱼能够对体内离子环境进行有效的调控。

血浆Cl-浓度会影响血浆的酸碱平衡，在低盐水体中，当血浆Na+的降低速度高于血浆Cl-的降低速度时，有可能导致鱼类发生短暂的代谢性酸中毒［28］，本研究中棕点石斑鱼从盐度32‰自然海水转移到盐度32‰、24‰、12‰、6‰环境中适应10 d后，盐度6‰组鱼血清Cl-浓度并没有随血清Na+、K+浓度的降低而降低，这预示着在该盐度下棕点石斑鱼可能会发生轻微的代谢性酸中毒。环境盐度的变化不仅会影响鱼类的体内离子平衡，并可能影响鱼类的生理状态，如游泳、食欲等［29］，在本研究中盐度6‰组棕点石斑鱼摄食几乎停止，活动量降低，这表明尽管在10 d时间内棕点石斑鱼能应对盐度6‰的水环境变化，但在该盐度环境中已经受到了低盐胁迫影响，可以预测，如果棕点石斑鱼长期暴露于盐度6‰下可能会对血清渗透压和离子平衡产生更严重的影响。

狭盐性海洋硬骨鱼的血浆渗透压为370～480 mOsm·kg-1，而狭盐性淡水硬骨鱼的血浆渗透压为260～330 mOsm·kg-1［30］，本研究中棕点石斑鱼血清渗透压随盐度的降低而降低，其渗透压变化范围介于两类之间，这表明棕点石斑鱼具有广盐性，经回归分析估算棕点石斑鱼等渗点343.73 mOsm· kg-1，所对应海水盐度为12.59‰，这与大部分广盐性硬骨鱼类等渗点相似［21］。

3.2 盐度对棕点石斑鱼鳃Na+／K+-ATPase活性及耗氧率的影响

鳃Na+／K+-ATPase是硬骨鱼类适应外界盐度变化、进行渗透压调节的关键酶，鳃Na+／K+-ATPase活性能反映机体对离子转运相关的能量需求［31］。不同鱼类鳃Na+／K+-ATPase活性与盐度变化的关系不同，主要有两种类型：1）一种是溯河性鱼类存在的线性关系，即随盐度的升高Na+／K+-ATPase活性随着增加［23］；2）多数广盐性鱼类存在“U”型关系，即鳃Na+／K+-ATPase在中等盐度下活性较低，在低盐和高盐下活性较高。在本研究中，棕点石斑鱼经过10 d的适应，随盐度的降低，Na+／K+-ATPase酶活性先降低后上升，符合“U”型变化，且在等渗点附近时具有较低的酶活性，这与军曹鱼（Rachycentron canadum）［32］、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）［33］、珍珠龙胆石斑鱼（E.lanceolatus×E.fuscoguttatus）［22］等相似，这是由于在等渗点环境细胞外液和环境水之间的离子梯度最小，保持离子平衡所需能量更少。

鳃Na+／K+-ATPase活性受基因表达变化的调控，许多研究表明，环境盐度变化不仅影响鱼鳃Na+／K+-ATPase活性，而且也影响NKA基因表达和蛋白的合成［34］。Na+／K+-ATPase具有复杂的分子异质性，有α和β类多种亚型表达。经10 d的低盐驯化，4种NKA亚型（α1，β1b，α2a和α3）中有3种亚基对低盐环境响应存在差异：NKAβ1b基因表达量随盐度的降低先降低后升高；NKAα2a基因表达量随盐度的降低先升高后降低；NKAα3基因表达量随盐度的降低而降低，这表明不同盐度环境下Na+／K+-ATPase分子结构存在差异，并可能在不同的盐度环境中发挥特定的作用［7］。有研究认为，NKAα1是影响Na+／K+-ATPase活性关键基因，经过一段时间适应后NKAα1基因表达量的变化与Na+／K+-ATPase活性变化一致［35-36］。也有研究表明，NKAβ基因表达量变化与Na+／K+-ATPase活性变化相一致［37］。在本研究中，各盐度组NKAα1基因表达量无明显变化，不同盐度Na+／K+-ATPase活性变化与NKAβ1b基因表达量变化趋势相似。有研究认为，鱼鳃表达多种α和β亚型，多亚型异构体可能会改变以适应盐度转移过程中外界水环境离子的变化［7］，并且β糖基化位点的突变可以改变酶的活性［38］，后续研究将关注此方面的内容。

鳃重构是鳃组织的形态学变化，由细胞活动所致，当硬骨鱼面临外环境盐度变化时经常发生，其典型特征就是细胞数量或大小发生变化［39-40］。鱼类在适应盐度变化过程中会引起泌氯细胞的改变或重塑，如中华鲟（Acipenser sinensis）幼鱼在半咸水条件下与在淡水条件下相比，鳃上皮泌氯细胞数量和大小均显著增加［24］；珍珠龙胆石斑鱼随盐度的降低，泌氯细胞长径变小，数量也略有减少［41］。这些改变对鱼类适应外界环境盐度变化有重要意义［42-43］，鳃Na+／K+-ATPase活性的变化可能受泌氯细胞数量或大小的变化影响而不仅是基因表达的变化［7］。在本研究中鳃泌氯细胞数量随盐度的降低先减少后增加，鳃小叶泌氯细胞在盐度32‰时最多，而各盐度组泌氯细胞的长径并无显著差异，这表明泌氯细胞的数量可能是影响鳃Na+／K+-ATPase活性变化的重要因素。

耗氧率反映了鱼类在静息状态所消耗的氧气，包括用于维持离子和渗透压调节、蛋白质结构转换和基本的心肺功能等的消耗量［44］。渗透压调节是一个耗能的过程，能量动态变化与平衡能准确反映鱼类对不同环境条件的适应性［45］，大部分鱼类总能量预算的20%～50%用于渗透压调节［46］。许多研究通过不同盐度下耗氧率来估算离子和渗透压调节成本［47］，但并没有形成共识。ERN和ESBAUGH［47］对美国红鱼（Sciaenops ocellatus）研究后认为，渗透调节的成本是基础代谢的次要组成部分，渗透压调节能量成本不能用全动物耗氧量来检测。在本研究中，随盐度的降低耗氧率有升高趋势，且在盐度32‰时最低，而在等渗点附近（盐度12‰）时耗氧率并没有明显降低，这表明在一定盐度范围内鳃Na+／K+-ATPase进行渗透压调节所消耗能量可能只是棕点石斑鱼总代谢的一个相对较小的组成部分。MUHAMMADAR等［19］通过研究棕点石斑鱼在盐度22‰、28‰、32‰水体中生长速度，认为棕点石斑鱼在盐度32‰条件生长速度最佳；TAHIR等［20］研究认为，与31‰盐度相比，棕点石斑鱼在5‰～15‰盐度时血清皮质醇水平及死亡率增加；MORGAN和IWAMA［48］研究认为，鱼类对盐度变化的代谢反应，在很大程度上取决于其生活史阶段，即物种在自然栖息地环境代谢率最低，比较适合其生长。该批棕点石斑鱼从孵化到养成一直生活在盐度32‰自然海水中，且在盐度32‰时耗氧率最低，这可能是长期盐度适应的结果。

本实验通过对棕点石斑鱼低盐适应10 d后血清渗透压、血清Na+、Cl-、K+浓度、鳃Na+／K+-ATPase活性及相关基因表达、鳃组织学及耗氧率等变化综合分析，在10 d时间内棕点石斑鱼能有效应对盐度6‰的水环境盐度变化，但已经受到了低盐胁迫，长期暴露于这种盐度可能会对血清渗透压和离子平衡产生更严重的影响。鳃Na+／K+-ATPase活性的变化不仅受NKA基因表达量影响，也受到了细胞数量变化的影响。研究同时发现，棕点石斑鱼在盐度12‰时鳃Na+／K+-ATPase活性最低，但代谢率在盐度32‰即自然栖息地盐度环境时最低，这表明在一定盐度范围内，鳃Na+／K+-ATPase渗透压调节所消耗能量可能只是棕点石斑鱼总代谢的一个相对较小的组成部分。