低盐条件下拟穴青蟹幼蟹氨基酸与脂肪酸含量变化研究

王亚美，赵 明，马凌波，马春艳，朱之发，史方方，王雪阳，王 伟，蒋科技，张凤英

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

拟穴青蟹（Scylla paramamosain）属软甲纲，十足目，梭子蟹科，青蟹属，常栖于比海水盐度稍低的泥沼与沟壑中，如入海口、潮间带和红树林等［1］。拟穴青蟹生长迅速、成体规格大、营养丰富，是我国东南沿海重要的经济蟹类［2］。随着经济繁荣和生活质量的提高，人们对水产品的需求量日益增加，水产品因其低脂肪和高蛋白质而备受青睐。由于海洋渔业资源日益匮乏，水产养殖成为渔业发展的重要方向。同时，海水品种的淡化养殖可减轻海水养殖对沿岸海洋环境的污染，也可促进内陆水产养殖业的发展，降低养殖成本，成为水产养殖重要的发展方向之一。青蟹属于广盐性甲壳动物，渗透调节能力较强［1］，使其成为低盐度水产养殖的优选物种。

盐度是影响甲壳类动物存活和生长的关键非生物因素，也是甲壳类水产养殖生产中的重要因素［3-5］。水生动物对盐度的生理反应涉及到各种组织（如肌肉、肝胰腺）的氨基酸和脂肪酸含量变化，甲壳动物储存的氨基酸、脂肪酸含量和组成是受外部环境和内部系统综合调节的结果，可在一定条件下反映机体的营养水平、摄食状况、健康水平及环境改变时机体的生理生化调节。已有研究报道，盐度可影响甲壳动物生长［6］及氨基酸［7-10］、脂肪酸［9，11-13］的组成和含量。目前，低盐胁迫对拟穴青蟹幼蟹氨基酸和脂肪酸含量的影响研究尚少见，本文通过对盐度20、10、0下拟穴青蟹幼蟹肌肉与肝胰腺中氨基酸和脂肪酸含量及组成进行分析，旨在探究低盐对拟穴青蟹幼蟹肌肉与肝胰腺中氨基酸和脂肪酸含量和组成的影响，为低盐养殖下青蟹营养成分的变化提供基础资料，并为低盐条件下幼蟹营养生理与营养需求研究提供一定的参考，丰富幼蟹营养学的内容。

1 材料与方法

1.1 实验材料及设计

实验用蟹为拟穴青蟹Ⅱ期仔蟹，取自本实验室福建养殖基地，挑选大小相同、健康、活力强、无残缺的个体共630只，平均体质量为（19.53±0.39）mg。由于青蟹领地意识强且相互蚕食，为排除抢夺食物、相互蚕食对本实验的干扰，采用单体养殖方式，制作630个可与周围水体充分交换的白色柱状塑料瓶（直径10 cm、高20 cm、水深约15 cm），每个瓶中放一只幼蟹，将瓶放置在水循环系统的玻璃养殖缸（1.6 m×0.65 m×0.45 m）中，瓶上编号并在底部铺设洗净曝晒过的细沙（厚约4 cm）。实验设置20、10和0盐度组，每组210只幼蟹。每个盐度组设置3个养殖缸，每70只幼蟹置于一个养殖缸内作为一个平行。

实验开始前将拟穴青蟹Ⅱ期仔蟹置于养殖缸里的瓶中，暂养7 d适应实验环境，暂养水体盐度为20，用曝气的淡水与浓缩盐卤混合配制盐水。采用曝气的淡水将每个养殖缸的盐度以每12 h降低2的速率调至实验所设计的盐度后开始正式实验，正式养殖实验时间为30 d。

1.2 养殖管理

在所有盐度组降为设置盐度后，每天观察记录拟穴青蟹生长和蜕壳存活状况，将新鲜缢蛏（Sinonovacula constricta）剥壳去掉腹腔内脏、外套膜、鳃后，剪成块，洗净，每个瓶中均匀投喂多块，保持每只蟹所投喂食物营养成分接近，饱食投喂，次日将残饵捞出。采用循环水系统将养殖水体进行过滤和净化处理，每个养殖缸连续24 h充氧，实验养殖期间水温保持在（26±2）℃，pH 8.0～8.3，溶氧量3.1～3.5 mg·L-1。每天测量各试验组水体盐度，必要时补充淡水以保持水体盐度稳定。

1.3 样品采集

养殖实验结束时，禁食24 h后取样，为排除蜕壳周期对营养成分的影响，取处于同一蜕壳阶段（蜕壳后第6天）的拟穴青蟹，将其从水循环系统转移到实验室，置冰上麻醉后解剖，分别取肌肉和肝胰腺。每个平行各取10只，每个盐度组分别取样30只，放置于-80℃冰箱中保存。

1.4 氨基酸和脂肪酸测定

氨基酸和脂肪酸含量测定参考国标方法［14］，氨基酸含量采用盐酸水解法（GB／T 5009.124-2003），经氨基酸自动分析仪测定。脂肪酸采用气相色谱法（GB／T 5009.168-2003）测定。

1.5 数据处理

实验结果采用平均值±标准差（mean±SD）表示，用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan多重比较法检验不同盐度组组间差异，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 氨基酸组成与含量

本实验在拟穴青蟹肌肉和肝胰腺中检测出17种氨基酸，包括9种必需氨基酸（EAA）和8种非必需氨基酸（NEAA），色氨酸（Tyr）在检测过程中的酸性水解中结构发生改变未被检出（表1，表2）。其中，NEAA中的Asp、Glu、Gly和Ala属呈味氨基酸（DAA）。

2.1.1 肌肉中氨基酸含量

不同盐度组肌肉中氨基酸含量见表1。肌肉中总氨基酸（TAA）、EAA、NEAA、DAA含量均随盐度的降低而显著减少（P＜0.05），呈现盐度20＞10＞0趋势。Asp、Ser、Glu、Thr、Gly、Ala、Val、IIe、Leu、Lys、His、Pro和Arg氨基酸含量也呈现此趋势。与盐度20组相比，盐度0组肌肉中氨基酸含量均降低；盐度10组肌肉中大部分氨基酸含量降低，Met和Tyr含量增加。与盐度20组相比，盐度10组TAA、EAA、NEAA含量分别降低6.32%、4.07%、7.54%，盐度0组分别降低12.92%、9.42%、14.81%。

表1 拟穴青蟹幼蟹肌肉中氨基酸含量（mg·100 g-1，湿重）Tab.1 Muscle amino acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.1.2 肝胰腺中氨基酸含量

不同盐度组肝胰腺中氨基酸含量见表2。TAA、NEAA含量在盐度10、0组中比盐度20组显著增加（P＜0.05），呈现盐度10＞0＞20（P＜0.05）趋势。盐度10组EAA含量大于 盐度0和20组，盐度0、20组EAA含量无显著差异。Asp、Thr、Ser、Glu、Ala、Val、IIe、His、Lys和Arg氨基酸含量也呈现盐度10＞0＞20趋势。与盐度20组相比，盐度10组TAA、EAA、NEAA含量分别增加20.16%、10.65%、26.67%，盐度0组分别增加5.92%、0.66%、9.52%。

表2 拟穴青蟹幼蟹肝胰腺中氨基酸含量（mg· 100 g-1，湿重）Tab.2 Hepatopancreas amino acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.1.3 各盐度下肌肉和肝胰腺中氨基酸的组成（%TAA）

如表3所示，从组织内氨基酸组成来看，所有盐度下拟穴青蟹的肌肉氨基酸组分中，NEAA比例均高于EAA。两组织之间相比，肝胰腺中EAA比例高于肌肉，肌肉中NEAA、DAA比例高于肝胰腺。低盐下，NEAA比例在肌肉中降低，在肝胰腺中增高。综合两组织来看，与正常盐度相比，低盐下EAA比例增高，NEAA比例降低。

表3 拟穴青蟹组织中不同氨基酸占各组织总氨基酸的比例（%TAA）Tab.3 Ratio of amino acids content to total amino acids content in tissues of Scylla paramamosain（%TAA）

2.2 脂肪酸组成与含量

2.2.1 肌肉脂肪酸含量

本实验在拟穴青蟹肌肉中检测出19种脂肪酸，包括10种饱和脂肪酸（SFA），4种单不饱和脂肪酸（MUFA），5种多不饱和脂肪酸（PUFA）（表4）。肌肉中总脂肪酸（TFA）、SFA、MUFA、PUFA含量均随盐度的降低而显著增多（P＜0.05），呈现盐度0＞10＞20趋势。肌肉中脂肪酸含量非常低，与盐度20组相比，盐度0、10组肌肉中各脂肪酸含量均增多。

表4 拟穴青蟹幼蟹肌肉中脂肪酸含量（mg·100 g-1，湿重）Tab.4 Muscle fatty acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.2.2 肝胰腺中脂肪酸含量

本实验在拟穴青蟹肝胰腺中检测出18种脂肪酸，包括9种SFA、4种MUFA和5种PUFA。肝胰腺中TFA、SFA、MUFA、PUFA含量均随盐度的降低而显著减少（P＜0.05），呈现盐度20＞10＞0趋势（表5）。与盐度20组相比，盐度10组 TFA、SFA、MUFA、PUFA 含量分别降低31.25%、32.35%、32.46%、28.18%，盐度0组分别降低52.85%、53.44%、46.60%、56.53%。

表5 拟穴青蟹幼蟹肝胰腺中脂肪酸含量（mg· 100 g-1，湿重）Tab.5 Hepatopancreas fatty acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.2.3 各盐度组织中脂肪酸的组成（%TFA）

如表6所示，各个盐度下的肝胰腺和肌肉脂肪酸组分中，SFA占各组织总脂肪酸的比例最高，其次为PUFA，MUFA最低。肌肉中的SFA和PUFA比例均高于肝胰腺，而MUFA比例低于肝胰腺。低盐下SFA比例在肌肉中增加，在肝胰腺中降低。PUFA、n-3PUFA、DHA比例：肌肉中为盐度0 ＞10＞20，肝胰腺中为盐度10＞20＞0，肌肉和肝胰腺两组织总和为盐度10＞20＞0。

表6 拟穴青蟹组织中不同脂肪酸占各组织总脂肪酸的比例（%TFA）Tab.6 Ratio of fatty acids content to total fatty acids content in tissues of Scylla paramamosain（%TFA）

如表7所示，综合各盐度处理组的两组织中氨基酸／脂肪酸含量总和得出，与盐度20组相比，盐度10组两组织中氨基酸总量增加0.36%，脂肪酸总量降低25.61%，盐度0组两组织中氨基酸总量降低8.14%，脂肪酸总量降低42.51%。

表7 不同盐度下拟穴青蟹肌肉和肝胰腺中TAA和TFA趋势、含量和变化率Tab.7 Trend，content and change rate of TAA and TFA in muscle and hepatopancreas of Scylla paramamosain in different salinities

3 讨论

氨基酸和脂肪酸在盐度适应中起重要作用［15］，拟穴青蟹机体中积累的氨基酸、脂肪酸含量是吸收／合成与消耗的综合结果，而其吸收／合成量与消耗量受食物营养、环境胁迫和胁迫适应能力等影响。

3.1 低盐胁迫对氨基酸的影响

低盐胁迫下，虾蟹中氨基酸含量和组成会发生变化。本研究中，拟穴青蟹肌肉中TAA、EAA、NEAA含量从大到小的顺序为盐度20＞10＞0。以往对不同盐度下养殖拟穴青蟹幼蟹的研究发现，盐度25组肌肉TAA含量（mg·g-1，干重）高于盐度5组［16］；中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）成蟹不同盐度养殖30 d，肌肉TAA含量为盐度20组高于0［9］；泥蟹（Panopeus herbstii）低盐下肌肉氨基酸也明显减少［7］，本研究结果与其一致。原因可能是因为低盐下氨基酸用于产能以应对低盐胁迫导致［17-20］，后续可进一步开展青蟹氨基酸相关代谢途径研究。

甲壳动物肝胰腺被认为是哺乳动物肝和胰腺的同源器官，是代谢反应的主要场所，其主要功能包括分泌酶、吸收和存储营养物质及卵黄发生等［21］。肝胰腺对营养物质的蓄积可反映机体对营养物质的需求。凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）低盐度下（盐度3）肝胰腺中总可溶性蛋白质含量显著高于中（盐度17）、高盐度（盐度32）（P＜0.05）［8］。本实验肝胰腺中TAA、NEAA含量呈现盐度10＞0＞20趋势（P＜0.05），表明降低盐度使肝胰腺中氨基酸含量增多，与先前报道中低盐下肝胰腺中氨基酸含量增多的结果一致［16］，具体机制需进一步探究。本研究肌肉中NEAA降低量、肝胰腺中NEAA增高量均高于EAA，NEAA可能在盐度胁迫中起重要作用。

3.2 低盐胁迫对脂肪酸的影响

水生广盐动物依靠能量重组来应对环境盐度的变化，水生动物的盐度胁迫是能量-消耗（占总代谢能量的20%～50%）过程［22］。脂类是重要的产能营养物质，代谢产生的许多脂肪酸是水生动物正常生长发育所必需的。

本研究在3种盐度中养殖拟穴青蟹幼蟹30 d后，所有盐度下肌肉中脂肪酸含量均极低，TFA随盐度下降而增加，呈现盐度0＞10＞20趋势。中华绒螯蟹成蟹不同盐度养殖30 d，肌肉脂肪酸含量为盐度0＞20［9］，本研究趋势与其一致，表明低盐胁迫可使拟穴青蟹肌肉中脂肪酸含量增加。本研究肌肉中n-3-PUFA、DHA的含量和占比随盐度的降低而增加，与锯缘青蟹（Scylla serrata）［11］、凡纳滨对虾［12］研究结果一致。盐度0组中肌肉SFA占比高于盐度10组和盐度20组，与曾霖等［20］研究报道的趋势一致。

肝胰腺是蟹类能量储存的重要器官［23］，与肌肉相比，盐度对肝胰腺中脂肪酸组成影响更大。在本研究中，低盐下拟穴青蟹幼蟹肝胰腺中TFA含量大幅降低，盐度0组TFA降低52.85%，盐度10组TFA降低31.25%，总脂肪酸含量为盐度20＞10＞0，与不同盐度养殖30 d后中华绒螯蟹成蟹肝胰腺总脂肪酸变化趋势（盐度20＞0）相同［9］。脂肪酸在盐度适应的能量补充中起重要作用，饱和脂肪酸主要通过氧化提供足够的能量以满足额外的能量需求［12，24］。水生动物的多不饱和脂肪酸受盐度影响较大，是海水水生动物维持细胞结构和机能完整性的重要生理功能物质［25］。n-3PUFA可提高水生动物对渗透胁迫的抵抗力，增加细胞膜渗透性和流动性［25-27］，也可增加鳃面积和酶效率，以提高低盐度渗透调节能力，并提高存活率［29-31］。研究发现低盐胁迫可显著增强肝胰腺中脂肪酸生物合成［32］，且低盐胁迫可促进脂肪动员和脂解能力［12］。本研究低盐下肝胰腺中脂肪酸含量降低，可能因为低盐下脂肪酸用于供能和增加膜流动性，且这种消耗量可能大于其食物摄取或自身合成量以致积累减少。

较高的n-3PUFA、DHA水平能提高对盐胁迫的耐受性和抵抗力，提高存活率，也在蜕皮和生长中发挥重要作用［26-29，33-34］。本研究盐度0组肝胰腺中PUFA、n-3-PUFA、DHA的含量和占比最低，可能是由于低盐度下幼蟹中脂肪酸消耗增加，且食物中没有足够的补充或拟穴青蟹低盐适应能力较低导致肝胰腺中储存降低。这可能也是本课题组发现盐度0组拟穴青蟹存活率很低、生长最慢的原因之一。与盐度20组相比，盐度10组肝胰腺中PUFA、n-3PUFA、DHA的含量降低，占比增加（盐度10＞20＞0）。先前报道锯缘青蟹幼蟹［11］在不同盐度下肝胰腺中n-3PUFA占比为盐度12＞20＞4，两者趋势一致，适当降低盐度可使肝胰腺中n-3PUFA、DHA占比增加。

4 小结

本文研究结果表明，在慢性低盐条件下，拟穴青蟹肌肉和肝胰腺中氨基酸、脂肪酸均产生了显著变化。肌肉中氨基酸含量下降，肝胰腺中氨基酸表现出一定积累；脂肪酸含量在肌肉中增多（所有盐度下肌肉中脂肪酸含量均很低），在肝胰腺中大幅下降。综合各盐度组两组织中氨基酸或脂肪酸含量总和得出，盐度10组两组织中总氨基酸含量及n-3PUFA、DHA比例增加，总脂肪酸含量降低；盐度0组两组织中总氨基酸、总脂肪酸含量及n-3PUFA、DHA比例均降低。本研究可为低盐养殖下青蟹营养成分的变化提供基础数据。在今后研究中，还需进一步探究氨基酸、脂肪酸代谢及其在适应环境盐度变化中的作用。可结合本实验各营养物质变化趋势，进一步开展低盐度下拟穴青蟹营养生理和营养需求试验，提高低盐度下青蟹的存活率及生长性能。