牛膝-续断治疗股骨头坏死的作用机制*

李金宗，侯德才，巩雪

1 辽宁中医药大学研究生学院 辽宁沈阳 110032 2 辽宁中医药大学附属医院 辽宁沈阳 110032

股骨头坏死（Osteonecrosis of the Femoral Head，ONFH）为难治性疾病，因其高度致残性之因引发越来越多的人群关注[1]。对于本病，保髋治疗作为一种重要治疗方法一直以来备受青睐[2]。《黄帝内经》有言：“不治已病治未病。”中医药向来遵循整体观念和辨证论治这个基本出发点，对方药和疾病的关系研究较少，因而探寻其药物应用在本病中存在重要研究价值。如今，随着中医药的日益发展，通过数据网络在系统生物学的理论基础上，聚焦所需要研究的蛋白、基因和通路，能够更加准确合理地指导中药在临床治疗中的运用[3]。并且“牛膝—续断”作为活血化瘀法治疗股骨头坏死的常用药物[4]，牛膝是苋科植物川牛膝的干燥根，产自四川。味苦、甘、酸，性平，归肝、肾经。牛膝味苦泄降，“走而能补，性善下行”，在活血化瘀的同时能通利关节、引血下行，而善治下焦瘀血证[5]。而续断具有补肝肾，强筋骨，续折伤的功效[6]。故而运用网络药理学及分子对接技术探寻其蛋白靶点效应关系及对股骨头坏死治疗作用机制有重要研究价值。故而采用此方法以达到探寻及了解其药物成分与疾病靶点之间的具体关系预测，从而为进一步临床观察研究及动物实验研究提供具体方向性指导。

资料与方法

1 活性成分及靶点筛选

以“牛膝”“续断”为关键词，通过中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/index.php） 的ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）功能，以口服生物利用度OB大于30%、类药性DL＞0.18 为筛选标准获得活性成分，并预测其靶点信息。通过Uniprot 数据库（https：//www.u-niprot.org/）搜索靶点相对应的人类基因，进行信息汇总。

2 检索已知的股骨头坏死靶点

在GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/）中，以“ANFH”“AVN”“ONFH”“osteonecrosis of the femoral head”及“femoral head necrosis”为搜索词，检索出与股骨头坏死相关的疾病靶点。

3 筛选药物-疾病共同靶点

利用R 语言4.1.2 获得牛膝-续断与股骨头坏死共同靶点，于Venny2.1 在线平台构建韦恩图进行可 视化。

4 牛膝-续断治疗股骨头坏死的蛋白间相互作用

使 用String 数 据 库（https：//cn.string-db.org/）PPI 分析功能处理共同靶点，选择物种为“人类”、置信度＞0.4，隐藏离散点，其余设置默认，获得可以展示蛋白相互作用的PPI 网络，从而明确牛膝-续断药对与股骨头坏死共同靶点蛋白间的相互作用。运用Cytoscape3.8.2 对PPI 网络进行美化，并且筛选出核心靶点。

5 共同靶点GO 及KEGG 富集分析

利用R 语言4.1.2 及org.Hs.eg.db 等相关程序包，对潜在共同靶点的生物过程（bio-logical process）、细 胞 组 分（cell component）、分 子 功 能（molecular function）这3 个方面分别富集分析，选择每项前10绘制可视化柱状图。选择KEGG 富集分析前20 条进行可视化。从而探究牛膝-续断药对治疗股骨头坏死的可能潜在作用机制。运用Cytoscape3.8.2 绘制“中药-靶点-疾病-通路”网络图，并对其进行网络拓扑结构的分析，按照 Degree 值大小筛选排名靠前的活性成分作为核心成分。

6 分子对接

于PubChem 数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载牛膝- 续断核心成分的2D 结构，作为 配 体。于PDB 数 据 库（https：//www.rcsb.org/）下载PPI 获得的核心基因相关蛋白结构，作为受体。在Pymol 软件对受体蛋白去水、加电荷、加氢。配体及受体均需在AutoDock1.5.6 更改为pdbqt 格式。运用Pymol 获得对接盒子xyz 坐标轴参数，输入Autodock-Vina 开始分子对接，这时计算机CPU 运算得出最低结合能。PyMol 获得的受体与配体结合的复合物，导入PLIP 平台进行分析，使用PyMol 对最佳分子对接模式进行可视化。

结果

1 牛膝-续断活性成分及靶点筛选结果

依照上述筛选标准，去重后共得出牛膝-续断药对27 种活性成分及202 个靶基因，见表1。

2 股骨头坏死靶点获取结果

选取国际公认的GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）中，去重得出股骨头坏死联系密切的已知潜在靶点2302 个。

3 药物与疾病的共同靶点获取

通过R 语言得到共同靶点125 个，于Venny2.1在线平台绘制韦恩图。见图1。

4 药物-疾病交集靶点的PPI 网络构建及核心靶点筛选

依照上述标准，使用String 数据库PPI 分析功能处理共同靶点，删除1 个离散节点，选择tsv 格式文件下载，并且导入Cytoscape3.8.2 构建PPI 网络图。见图2。PPI 关系互作图包括124 个节点和2484 条边，利用CytoNCA 插件拓扑结构分析，根据接近中心性CC、借助度中心性DC、介度中心性BC、局部边连通性LAC 和网络中心性NC、特征向量中心性EC 这6 个指标，以大于中位数为标准，进行3 次计算分析，过程见图3。获得5 个核心基因，分别是AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN。见表2。

表2 核心基因

图2 PPI 网络图

图3 PPI 网络核心基因筛选流程图

5 GO 靶点通路分析结果

GO 富集分析表明，牛膝-续断治疗股骨头坏死靶点影响了2047 个生物学过程，43 个细胞组分，128个分子功能。BP 主要涉及对脂多糖的反应、对细菌源分子的反应、对异种刺激的反应、对营养水平的反应。对类固醇激素的反应、对活性氧的反应、伤口愈合、对氧化应激的反应、对辐射的反应、细胞对化学胁迫的反应等；CC 主要与膜筏、膜微域、凹陷、水泡腔、质膜筏、分泌颗粒管腔、胞质小泡腔、转录调节复合体、富含无花果-1 的颗粒管腔、细胞器外膜等相关；MF 主要涉及DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子结合、核受体活性、配体激活的转录因子活性、转录共激活因子结合、细胞因子受体结合、转录辅助调节因子结合、类固醇激素受体活性、血红素结合、四吡咯结合等。选取富集结果每项显著性前10 绘制柱状图，展示GO 功能与其涉及基因数的对应关系。见图4。

图4 GO 富集分析

6 KEGG 富集分析结果

共同靶点KEGG 富集分析（P＜0.05）得到通路165 条，富集比较明显的前20 个通路包括：脂质与动脉粥样硬化、晚期糖基化终产物及其受体AGE-RAGE信号通路、流体切应力与动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝、前列腺癌、肿瘤坏死因子信号通路、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎、化学致癌-受体激活、小细胞肺癌、膀胱癌、恰加斯病、胰腺癌、麻疹、甲型流感、缺氧诱导因子-1 信号通路、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、弓形虫病等。见图5。

图5 KEGG 富集分析

7 “中药-靶点-疾病-通路”网络图

将KEGG 富集分析筛选出的20 条信号通路，运用Cytoscape3.8.2 分析“中药- 靶点- 疾病- 通路”相互作用网络。该网络包括286 个节点和1080 条边，利用CytoNCA 插件拓扑结构分析，Degree 值越大网络中的节点越大。见图6。并按照 Degree 值大小筛选出排名前5 的活性成分作为牛膝-续断的核心成分。见表3。

图6 “中药-靶点-疾病-通路”网络图

表3 Degree 值排名前5 的活性成分

8 分子对接分析结果

选择核心成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素作为小分子配体，选择核心基因AKT1（PDB 2Z25）、TNF（PDB 2Z25）、IL6（PDB 1ALU）、TP53（PDB 4MZI）、JUN（PDB 1JNM）作为受体，进行虚拟分子对接。研究表明，结合能为负数时配体与受体不需要外界助力即可结合，并且结合能的数值越低，对接模式越稳定。见表4。结果可知，槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素与AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN 这5 个靶点能形成稳定氢键，且结合能均为负数，表明牛膝-续断治疗股骨头坏死效果颇佳。对结合能均低于-10kJ/mol 的6 种对接模式，使用PyMol 软件进行可视化。见图7。

图7 分子对接模式图

表4 牛膝-续断核心成分与靶点的结合情况

讨论

股骨头坏死与血液紊乱、代谢和凝血障碍有关[7]。在中医理论中虽无本病名称，但是发病症状及体征判断可与中医学中“骨痹”相吻合。因而中医理论对本病的临床治疗指导作用毋庸置疑。王均玉等[8]通过经筋理论对股骨头坏死的症状进行对症干预，以促进局部血液循环实现良好治疗目的。张涛等[9]从血瘀理论出发，运用骨蚀方以及配合蛙泳姿势对股骨头坏死早期干预达到良好效果。这说明中医学中“血瘀”理论与本病关系极其密切。因而探讨牛膝-续断药对对于活血化瘀方法干预股骨头坏死，其理论对临床有重要指导价值。

中药药对“牛膝—续断”与股骨头坏死疾病取共同交集，结果发现共同靶点数为125 个，说明此药对存在股骨头坏死相关干预作用机制。文献研究显示，长期小剂量应用或短期大剂量应用糖皮质激素均可通过影响ROS/JNK/c-Jun 通路相关作用诱导大鼠股骨头坏死[10]。又PRP-Exos 可通过介导Akt/Bad/Bcl-2 信号通路来抑制糖皮质激素相关内质网应激，从而诱导股骨头坏死大鼠的细胞凋亡[11]。已有研究表明，股骨头缺血性坏死患者血清和骨组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平高于正常人，提示TNF-α 可能在股骨头坏死的发病机制中起一定作用。其研究数据显示，与健康患者相比，股骨头缺血性坏死患者骨组织中TNF-α 表达显著上调，并且明显激活了p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）信号通路。文献显示，虽然有部分p38mapk/NF-κB 通路的抑制显著减弱了TNF-α诱导的自噬，但增强了TNF-α 诱导的成骨细胞凋亡。股骨头坏死患者体内TNF-α 增加，通过p38-MAPK/NF-κB 信号通路调节成骨细胞自噬和凋亡，进而抑制自噬流量阻断该通路，从而加剧TNF-α 诱导的凋亡[12]。TP53 也与细胞凋亡密切相关。股骨头坏死患者骨髓以及成骨细胞凋亡，导致股骨头头部出现塌陷，头部与髋臼连接的圆形表面变平，最终引发继发性骨关节炎[13]。IL6 与炎症反应密切相关，是细胞因子网络的主要参与者[14]，可参与调节免疫应答，造血，急性期反应和炎症反应等相关生物过程[15]。而股骨头坏死最终伴随骨性关节炎[16]，因而与IL6 的参与密不可分。

本次研究显示，“中药-靶点-疾病-通路”调控网络中含有最多相关靶基因的有效成分分别为槲皮 素（Quercetin）、β- 谷 甾 醇（Beta-sitosterol）、山柰酚（Kaempferol）、汉黄芩素（Wogonin）以及黄芩素（Baicalein）。其中，槲皮素（Quercetin）为一种从植物中提取的多酚，其拥有包括抗炎在内等多种生物学作用[17]。山柰酚（Kaempferol）为膳食类生物黄酮之一，通过抑制脂肪形成、炎症反应、氧化应激，拮抗破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，激活成骨细胞自噬，从而实现骨保护作用[18]，对股骨头坏死在内的骨性关节炎有良好干预。并且汉黄芩素（Wogonin）和黄芩素（Baicalein）也可抗氧化，抗炎和抗细胞凋亡，对缺血性疾病也有良好干预作用[19]。

KEGG 分析结果显示，脂质与动脉粥样硬化，IL-17 信号通路，肿瘤坏死因子信号通路，流体切应力与动脉粥样硬化，缺氧诱导因子-1 信号通路为主要信号通路。根据文献研究结果显示，导致动脉粥样硬化所相关的脂质代谢异常的危险因素，包含股骨头坏死在内的多种疾病[20]。这也正如中医理论中所言，营气为濡养全身的重要物质，是化生血的主要来源。又因气为血之帅，而统领血行；而血为气母，濡养一身之气，二者相关密不可分。气属无形而血属有形，形者为精微物质即气血的最终客观形体存在，骨为精所化，髓乃精所生，气血不畅则精无生而骨乃坏也。内皮细胞将血液流动的摩擦力（流体剪切力）转化为生物化学信号，通过特殊的机制和途径调控基因表达和细胞行为。这些通路在发育期间、出生后和成年时期塑造血管系统，以优化流向组织的流动。这些途径也会导致动脉粥样硬化和血管畸形[21]，导致局部血流变化甚至血流量减少，而股骨头周围血流量及局部血流的减少，被认为是发病的重要原因之一[22]。同时肿瘤坏死因子TNF 在炎症、细胞凋亡、细胞增殖和免疫系统刺激等方面也是发挥着重要的多效性作用[23]。

通过分子对接发现，核心成分槲皮素、β- 谷甾醇、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素与核心蛋白AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN 的结合能均为负数。说明核心成分可以自动结合核心蛋白，并且发挥作用，通过介导激活或抑制其相关通路，达到对股骨头坏死的干预作用。

综上所述，中药“牛膝-续断”药对中包括山奈酚在内的多种化学成分可对股骨头坏死发病进行多成分，多靶点，多通路的干预治疗。尤其通过山奈酚介导其脂质与动脉粥样硬化，流体切应力与动脉粥样硬化通路以达到恢复股骨头周围血运能力，达到从瘀来论治本疾病。本研究对临床治疗股骨头坏死的作用机制具有借鉴意义，同时也为更临床应用提供了理论支撑。但由于数据库信息不全面、药材成分差异等问题，结论仍待进一步实验和临床研究验证。