半夏泻心汤治疗胃食管反流病的作用机制探讨*

杨璧英，黄柳向

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208 2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是指胃十二指肠内容物反流入食管引起烧心等症状的疾病，我国GERD 的发病率呈上升趋势[1]。GERD 主要分为非糜烂性反流病（non-erosive reflux disease，NERD）、反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）和Barrett 食管 （Barrett esophagus，BE）三大临床类型。目前，GERD 在我国患病率约12.5%[2]。中医根据临床症状，将GERD 归属于“食管瘅”“噫醋”“吐酸“等范畴[3]。《医林绳墨》指出该病为胃口之酸水攻激于上，于咽嗌之间，致酸味刺心，揭示了本病的病位涉及食管和胃，并与肝、胆、脾、肺密切相关，朱震亨言：“一有怫郁则诸病生焉”“传化失常则六郁病见”。GERD 总以肝木之“气郁”为病机旨要，肝木气机拂郁，致结聚不得发越，横逆犯胃，酿酸上渍食道发为本病[4]。此外，李氏[5]在临床试验中得出，通过证素辨证理论证实半夏泻心汤治疗吐酸的有效率高达96.2%。因此，这也为半夏泻心汤治疗GERD 的临床应用提供了充分的理论依据。相关文献也表明，中医药治疗GERD 的临床疗效确定、价格低廉、复发率低[6]，具有一定的特色和优势。

资料与方法

1 半夏泻心汤有效成分的收集与筛选

通 过TCMSP 平 台（https：//tcmspw.com/）[7]收 集半夏泻心汤中半夏、黄连、黄芩、干姜、甘草、人参、大枣七味药物的的活性成分和对应靶点，并按文献报道[8]，将药代动力学（ADME）参数设为：口服生物利用度（OB ≥30%，类药性（DL）≥0.18，筛选符合条件的有效成分，挖掘出此七种药物的作用靶点，并通过Uniprot 平台进行靶点名字转换。

2 半夏泻心汤药材-有效成分-靶点网络的构建

通过TCMSP 数据库获取半夏泻心汤中七味药有效成分所对应的靶点信息，将所有靶点合并、去重，并通过UniProt 数据库下载注释文件，对其名称标准化，然后利用Cytoscape3.8.2 软件，构建可视化网络。

3 疾病靶点的获取

Genecardss 是人类基因纲要，使研究人员能够有效地搜寻和关联人类基因、疾病、变异、蛋白质、细胞和生物途径[9]。利用GeneCards（https：//www.genecards.org/）数 据 库 以“gastroesophageal reflux disease”为关键词搜索与胃食管反流病相关发病机制靶点，得到胃食管反流病靶点，并绘制中药靶点与疾病靶点的韦恩图，得到交集靶点。

4 蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）的构建

采用计算机R 语言中venn 程序包绘制半夏泻心汤与GERD 交集靶点韦恩图，将其导入STRING（https：//string-db.org/）数据库中建立PPI 蛋白互作网络，并利用Cytoscape3.8.2 软件中CytoNCA 插件对核心蛋白进行多种中心性的计算，筛选关键靶点。

5 GO 功能与KEGG 通路富集分析

采用计算机R 语言中clusterProfiler 程序包对交集靶点进行GO 功能和KEGG 通路分析，并绘制气泡图进行可视化。

6 分子对接验证

分子对接是基于计算机技术，虚拟预测分子配体与靶标的方法，是药物设计领域的重要手段之一[10]。在PubChem（https：//www.rcsb.org/）中得到半夏泻心汤中化合物的2D 结构，并导入Chem3D 软件得到优化后的3D 结构；通过PYMOL 软件去除了水分子和配体，分离蛋白结构。采用AutoDock 软件并运用Grid模块设置蛋白原配体为对接盒子中心，其格点盒子大小设定为40×40×40，并对配体小分子可能发生作用的区域进行设定，利用AutoDock Vina 分子模拟软件对药物小分子和靶蛋白受体进行分子对接分析。

结果

1 半夏泻心汤有效成分及相关靶点的筛选

通过TCMSP 数据库检索半夏泻心汤中7 种中药的化合物数据及对应的靶点，以OB ≥30% 和DL ≥0.18 为筛选条件，所得化合物中半夏12 个、黄连 11 个、黄芩31 个、干姜5 个、甘草88 个、人参17 个、大枣19 个。将所得化合物去重后共得到148 个化合物。将所得靶点去重后共得到95 个靶点。

2 构建半夏泻心汤药材-有效成分-靶点网络

将2.1 中数据导入Cytoscape 中，绘制半夏泻心汤-胃食管反流病网络图（图1），该网络图中共包括148 个有效成分节点和95 个靶基因节点，共243 个节点，见图1。

图1 半夏泻心汤药材-有效成分-靶点网络

3 半夏泻心汤靶点与GERD 靶点交集分析

合并去重得到GERD 靶点1257 个，将药材与疾病靶点映射后，共得到靶点93 个，见图2。

图2 半夏泻心汤与胃食管反流病共同靶点韦恩图

4 构建交集靶点PPI 网络

利用STRING 平台，对交集靶点构建PPI 网络图，见图3。通过 Cytoscape3.8.2 插件 CytoNCA 对共有靶点进行拓扑分析，根据degree 值大小筛选前27 位关键靶点，进行网络构建得到图4 所示网络，并最终提取10 个关键的靶点（图4 黄色标记部分）。

图3 交集靶点蛋白网络互作图

图4 关键靶点蛋白网络互作图

5 GO 富集分析

通过 UniProt 工具将关键靶点的名称转为对应的Entrez ID，利用R 语言中的“ClusterProfiler”等程序包进行GO 富集分析，根据基因富集数目与显著程度，筛选排名前30，通过R 语言包绘制GO 功能注释条图及气泡图进行可视化处理，见图5、图6。对靶点的GO 富集分析结果显示：这些靶点富集在生物过程中显著的条目有对金属离子响应、对药物响应、对脂多糖的响应、对辐射的响应、细胞对化学压力的响应、对营养水平的响应、对细胞外刺激的响应等生物学过程。

图5 GO 功能注释条图

图6 半夏泻心汤治疗GERD 的核心靶点 GO 基因功能富集分析气泡图

6 关键靶点的KEGG 通路分析

采用计算机R 语言中"colorspace""stringi""DOS E""clusterProfiler""pathview""clusterProfiler" 等程序包，筛选排名靠前的20 条通路，得到KEGG 注释条图（图7）、气泡图（图8）。通路富集分析结果显示主要涉及脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症、流体剪切应激、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染的年龄、AGERAGE 信号通路、膀胱癌、内分泌抵抗性丙型肝炎、胰腺癌和前列腺癌、人类巨细胞病毒感染、癌症相关蛋白聚糖、IL-17 信号通路、结直肠癌、肿瘤坏死因子信号通路、麻疹、肝癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、弓形体病等。

图7 KEGG 功能注释条图

图8 半夏泻心汤治疗GERD 的核心靶点KEGG 基因功能富集分析气泡图

7 分子对接文件准备

通过Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得小分子配体2D 结构，再通过ChemOffice 软件将2D 结构转换为3D，为文件1。通过PDB（http：//www.rcsb.org/）数据库下载蛋白受体，使用PyMol 软件删除蛋白受体的水分子和小分子配体，获得文件2。将文件1 和文件2 转化为PDBQT 格式并确定活性口袋，获得活性口袋相关信息。

8 分子对接结果

通 过Cytoscape3.8.2 插 件 CytoNCA 对 共 有 靶点进行拓扑分析，根据过滤值BC＞59.68258267、CC＞0.426470588、DC＞20、EC＞0.065383181、LAC＞10.65、NC＞12.307222905 筛 选 出 最 终10 个核心基因，将10 个核心基因EGFR、TP53、STAT3、MAPK3、RELA、MAPK14、JUN、AKT1、CTNNB1、CASP3 与其相对应的小分子配体槲皮素、柚皮素、β-胡萝卜素、甘草查耳酮A、3’-甲氧基光甘草定、汉黄芩素、黄芩黄素等通过vina 软件进行分子对接分析，结果为图9。每个基因相对相应的最低结合能分 别 为：-8.5kcal/mol、-8.5kcal/mol、-8.0kcal/mol、-8.3kcal/mol、-9.6kcal/mol、-7.6kcal/mol、-8.7kcal/mol、-8.6kcal/mol、-10.0kcal/mol、-8.4kcal/mol，其 中CTNNB1 的对接分值最低，结合最稳定。据相关文献报道，结合能小于-5.0 kcal/mol 是分子对接时配体和受体稳定结合的标准，结合能越低分子结构稳定性越高[11]。分子对接结果显示，核心成分与核心蛋白的结合能均小于-8kcal·mol-1，构象稳定，能形成稳定的氢键和疏水作用。说明核心成分能与核心蛋白结合起效，并通过激活或抑制核心蛋白的相关通路，从而达到治疗胃食管反流病的作用。

图9 分子对接三维图（ 处为分子对接位置 ）

讨论

典型和常见的GERD 症状为烧心和反流，其他少见或不典型的相关症状包括上腹痛、上腹不适、胸痛、嗳气、腹胀、咽部异物感、吞咽痛、吞咽困难等，此外还有食管外症状，如慢性咳嗽、咽喉炎、哮喘等[12]。GERD的病位主要在食管与胃，与肝胆脾肺密切相关，病性有虚有实，虚主要是脾胃虚损，实主要是为气郁、食滞及痰凝，胃有失和降，气逆于上，脾胃功能失职，以至水谷不化、水湿不运，聚而为痰为饮，痰饮阻肺，导致肺的宣发肃降失常，同时肝胆气机疏泄失常，肝胆郁热而犯胃是GERD 的主要病因病机[13]。半夏泻心汤乃张仲景治疗寒热错杂之良方，以寒热共伍、攻补兼施、苦辛并进、阴阳并调为组方特点。现代研究表明该方具有增强胃动力、双向调节胃肠运动、保护消化道黏膜、提高机体免疫力等多种功能[14]，半夏泻心汤中用半夏散结除痞，又善降逆止呕为君药，臣以干姜之辛热以温中散寒，黄芩、黄连之苦寒以泄热开痞[15]。以上四味相伍，具有寒热平调、辛开苦降之用，然寒热错杂，又缘于中虚失运，故方中又以人参、大枣甘温益气，以补脾虚，为佐药，使以甘草补脾和中而调诸药[15]。契合胃食管反流病主要病机证候。

目前胃食管反流病的发病机制比较复杂，尚未完全明确，本文基于网络药理学联合分子对接方法，构建了药材-有效成分-靶点网络、靶点蛋白 PPI 网络、药材-成分-靶点-通路网络，对半夏泻心汤治疗胃食管反流病的分子机制进行预测分析，为半夏泻心汤的后续深入研究提供科学依据。本研究结果显示槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）、甘草查耳酮A（licochalcone a）、3’-甲氧基光甘草定（3'-Methoxyglabridin）、汉黄芩素（wogonin）、黄芩苷（baicalein）、β-胡萝卜素（beta-carotene）等为半夏泻心汤方主要活性成分。基础研究发现槲皮素因具有广泛的药理学作用，现在受到了越来越广泛的关注，它是一种天然的黄酮类化合物，其优势是具有多靶点作用和综合治疗优势的一个中药单体[16]。柚皮素抑制 FaDu 细胞增殖、侵袭可能与 ZFP36 蛋白表达上调有关，提示ZFP36 可能是一种新型柚皮素靶点，ZFP36 参与多种肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，在肿瘤发生发展中起着重要的生物学作用[17]。甘草查耳酮A 具有广泛的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性，且甘草价格低廉含量丰富，具有广阔的应用前景[18]。已经有研究表明，甘草查尔酮A 在小细胞肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等诸多癌症中具有明显抑制肿瘤细胞活性及肿瘤组织生长的作用[19-21]。有研究表明，汉黄芩素可显著抑制类风湿关节炎成纤维滑膜细胞增殖，诱导其凋亡，并可显著下调炎症因子IL-6 水平[22]。黄芩苷是黄芩的药效物质基础，也是黄芩质量控制的主要植物化学标志，具有抗病毒、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、保肝、利胆、免疫调节等多种药理作用，尤以抗真菌、细菌作用最为显著[23]。

PPI 网络拓扑学分析显示，EGFR、TP53、STAT3、RELA、AKT1 等为半夏泻心汤治疗GERD 的潜在作用关键靶点。EGFR 是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的酪氨酸激酶型受体，属于ErbB 受体家族的一种，EGFR 在部分肿瘤细胞中呈过表达，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关[24]。Dong 等研究发现肺腺癌中突变频率较高的KRAS联合TP53 共突变可以预测肿瘤免疫治疗疗效[25]。STAT3 信号通路是细胞内参与凋亡及炎症信号转导的重要通路，能被多种代谢产物激活，引起炎症因子表达增多，促进细胞凋亡[26]。该蛋白质属于NF-κB 通路中枢信号复合物的一部分，NF-κB 通路在机体炎症的发生、自身免疫过程以及肿瘤的发生发展中发挥重要作用[27]。AKT1 信号通路参与胃癌的发生、发展、浸润转移，在胃癌的癌变过程中起着重要作用，并有研究证明，干扰AKT1 表达能抑制胃腺癌细胞增殖、迁移等行为[28-29]。

GO 与KEGG 分析结果显示，半夏泻心汤可能通过干预对金属离子响应、对脂多糖的响应、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症、流体剪切应激、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、AGE-RAGE 信号通路、膀胱癌、内分泌抵抗性丙型肝炎、胰腺癌和前列腺癌、人类巨细胞病毒感染、癌症相关蛋白聚糖、IL-17 信号通路等来治疗GERD。AGE-RAGE 信号通路介导了多种细胞的损伤过程[30]。IL-17 信号通路是促炎的细胞因子，可引起核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路激活，引起下游效应因子转录，促进细胞增殖，血管生成，参与机体的炎性反应[31]。

分子对接结果显示，核心成分与核心蛋白的结合能均小于-8kcal·mol-1，构象稳定，能形成稳定的氢键和疏水作用。说明核心成分能与核心蛋白结合起效，并通过激活或抑制核心蛋白的相关通路，从而达到治疗胃食管反流病的作用。

综上所述，本研究发现半夏泻心汤有效成分可能通过抑制细胞凋亡、减轻炎性反应、减少细胞增殖、迁移、抑制肿瘤细胞的增殖、促进血管新生等作用，从而达到治疗胃食管反流病的效果，其机制可能与AGERAGE 信号通路、IL-17 信号通路等通路有关。但要注意的是本研究仍存在许多不足之处，比如使用的数据库不全面，筛选策合理性有待提升，未考虑煎煮后中药活性成分的改变，易忽视其他可能发挥潜在作用的活性成分。因此本次研究只是初步预测了半夏泻心汤的作用机制，为基础研究与临床提供一个方向，后续还需要进一步的相关研究加以验证。