基于网络药理学探索脾胃培源方治疗胃癌的作用机制*

裴蓓，温子昂，郑艳敏，李学军

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230012 2 安徽医科大学研究生院 安徽合肥 230031 3 中国科学院合肥物理研究所 安徽合肥 230031 4 安徽中医药大学第二附属医院 安徽合肥 230000

胃癌（Gastric Cancer，GC）是一种起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。几乎95%的胃癌是腺癌。在中国，胃癌是继肺癌、乳腺癌和结肠癌之后发病率和死亡率最高的一种恶性肿瘤，其5年生存率仅为29%。虽然近年来中国胃癌的发病率有所下降，但死亡率却没有明显下降[1-2]。目前，手术是胃癌的主要治疗手段。然而，由于术后的高复发率和严重并发症，患者的最终预后往往都很差[3]。

脾胃培源方是李学军教授在李东恒脾胃病理论基础上，结合国家级名老中医马骏教授临床经验总结出来的经验方。本方主要由白术、黄芪、香附、桂枝、白芍、刘寄奴等六味药组成。后世有云：“脾胃为后天之本、气血生化之源”。李学军教授结合临床经验提出胃癌病机多为“脾胃虚弱，气滞血瘀”。脾胃虚弱，运化失司，气血乏源，失于濡养，久则气滞血瘀积成癌症。《黄帝内经》云：“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”。正气不足是疾病发生的根本原因。故以“调平归源”为治疗大发，益气和中，培补脾胃，提高机体的抗病能力[4]。基于现有的临床证据，脾胃培源方在治疗胃癌上具有良好的疗效，能够有效缓解患者的症状，但尚缺乏对脾胃培源方治疗胃癌作用机制的研究。

与其他中药方剂类似，脾胃培源方也是一种多成分、多靶点的药物，通过活性成分调节分子网络来达到疗效。网络药理学是新兴的生物信息学技术，它综合了基因组学、蛋白质组学和药理学的相关信息，通过网络药理学方法构建“疾病-基因”生物网络图和“药物-靶点”生物网络图，可以系统、全面地了解某种药物治疗疾病的具体作用机制[5-6]。为进一步探索脾胃培源方治疗GC 的作用机制，本研究采用了网络药理学的方法预测脾胃培源方的潜在分子机制。

方 法

1 预测脾胃培源方的作用靶点

使 用TCMSP 数 据 库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）获取脾胃培源方的作用靶点。TCMSP 包含了在《中国药典》中注册的499 种中药材，包括29384 种成分、3311 种靶点和837 种相关疾病的信息[7]。中药多为口服药，根据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和药物相似点（Drug Likeness，DL），可以选择有效成分和相关目标[8-9]。我们以OB ≥30% 和DL ≥0.18 为标准，筛选脾胃培源方的有效成分和相关作用靶点。

2 收集与胃癌发病相关的基因数据

使 用Genecards 数 据 库（https：//www.genecards.org）和OMIM 数据库（http：//www.omim.org）两大通用数据库获取胃癌发病的相关基因数据。GeneCards是一个全面、权威的人类基因信息数据库，已经被广泛使用了近26年[10]。数据库中包含了73000 多个人类基因。我们以“胃癌”为关键词，选择了关联度大于中位数（1.55）的相关基因，同时删除重复的基因。

3 蛋白质-蛋白质相互作用分析

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是大多数细胞中生物过程的基础，对于了解正常和疾病状态下的细胞生理学至关重要。我们利用STRING 数据库（http：//string-db.org）对获得的具有生物活性的化学成分和胃癌靶点进行PPI 网络映射，物种限定为 "智人"。用Cytoscape（3.7.2 版）[11-12]构建靶点-信号通路相互作用网络，可以用来分析DNA、蛋白质和相关信号通路相互关系。

4 GO 和KEGG 分析

基因本体论（GO）为基因组学提供了相关生物学信息，同时定义了与基因功能有关的概念[13]。京都基因和基因组百科全书（KEGG）是一个以其路径信息而闻名的数据库[14]。它是一个可以将基因组信息与生物功能信息联系起来系统分析基因功能的强大数据库。为了研究脾胃培源方的生物学效应，我们对其进行了GO 分析和KEGG 通路富集分析，并通过STRING 数据库（http：//string-db.org）进行计算，以校正后的P值＜0.01 为标准进行分析。

5 分子对接实验

根据脾胃培源方的相关网络图和胃癌的信息，我们对脾胃培源方的主要成分和目标进行了分子对接实验。首先通过TCMSP 数据库下载了脾胃培源方中主要有效成分化学结构的三维（3D）结构图，将其导入AutodockTools 1.5.6 软件进行氢化和能量优化，然后将其保存为mol2 格式文件。我们再对这些化合物进行结构修饰，加入电荷，显示可旋转键，将所得结构的文件保存为pdbqt 格式。我们再从PDB 数据库下载目标基因对应的蛋白质结构，将结构文件导入PyMOL 软件中，去除水分子和异质分子，导入AutoDockTools 1.5.6 软件中添加氢原子，将所得结构文件保存为pdbqt 格式。最后，以化合物为配体，以目标基因对应的蛋白质为受体进行分子对接。根据Autodock vina 1.1.2 软件的经验评分功能确定结合点，对接过程由Autodock vina 1.1.2 软件完成。

结果

1 成分和目标分析

通过TCMSP 数据库，我们得到了白术的55 种成分，黄芪的87 种成分，香附的104 种成分，桂枝的220种成分，白芍的85 种成分和刘寄奴的46 种成分。删除没有匹配靶点的有效成分，并根据口服生物利用度（OB）和药物相似度（DL）值筛选出了6 种药物的有效成分。最终，67 种有效成分被发现，如槲皮素、异鼠李素、木犀草素和山柰酚等（见表1）。

表1 脾胃培源方的活性成分一览表

香附 MOL004027 1，4-Epoxy-16-hydroxyheneicos-1，3，12，14，18-Pentaene 45.10 0.24香附 MOL004053 Isodalbergin 35.45 0.20香附 MOL004058 Khell 33.19 0.19香附 MOL004059 Khellol glucoside 74.96 0.72香附 MOL010489 Resivit 30.84 0.27香附 MOL004068 Rosenonolactone 79.84 0.37香附 MOL004071 Hyndarin 73.94 0.64香附 MOL004074 Stigmasterol glucoside_qt 43.83 0.76香附 MOL004077 Sugeonyl acetate 45.08 0.20香附 MOL000422 Kaempferol 41.88 0.24香附 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76香附 MOL000006 Luteolin 36.16 0.25香附 MOL000098 Quercetin 46.43 0.28桂枝 MOL000073 ent-Epicatechin 48.96 0.24桂枝 MOL000492 （+）-Catechin 54.83 0.24桂枝 MOL001736 （-）-Taxifolin 60.51 0.27桂枝 MOL004576 Taxifolin 57.84 0.27桂枝 MOL000359 Sitosterol 36.91 0.75桂枝 MOL011169 Peroxyergosterol 44.39 0.82刘寄奴 MOL001733 EUPATORIN 30.23 0.37刘寄奴 MOL000358 Beta-sitosterol 36.91 0.75刘寄奴 MOL000006 Luteolin 36.16 0.25刘寄奴 MOL008127 Ermanin 58.95 0.30刘寄奴 MOL008135 3，4-di-O-caffeoylquinic acid 49.62 0.69

2 胃癌与脾胃脾胃培源方的靶点

我们通过Genecards 数据库获得了9877 个胃癌的靶点，以得分大于中位数1.55 为标准进行筛选靶点。在整合数据库中的靶点信息后，最终筛选出了4938 个靶点。

3 靶点-信号通路交互网络图的构建

根据从TCMSP 数据库中得到的脾胃培源方活性成分的作用靶点，以及筛选出的胃癌靶点，我们对其进行交互，通过Venn 2.1 建立维恩图，获得181 个共同靶点作为脾胃培源方治疗胃癌的主要作用靶点（图1）；使用STRING 数据库对所得的主要靶点构建PPI网络（图2）；使用Cytoscape 3.7.2 构建靶点-信号通路交互网络图（图3）。在获得的靶点中，许多靶点都参与了抗炎、促进细胞增殖、血管生成和抗肿瘤的过程，如MAPK1、TP53、IL-1、Fox 和Bax 等[15-18]。

图1 脾胃培源方治疗胃癌主要作用靶点的韦恩图

图2 蛋白质-蛋白质相互关系网络图

图3 靶点-信号通路相互关系网络图

4 GO 和KEGG 通路富集分析

为了从系统水平阐明潜在CAG 靶点的多种生物学功能，进行了GO 富集和KEGG 通路富集分析。GO富集分析包括生物学过程、分子功能和细胞成分在内的三个部分。我们将181 个目标信息输入STRING 数据库进行GO 分析。根据P 值选择前24 个结果（图4）。

图4 靶点基因GO 分析

此外，根据 KEGG 通路富集分析的结果，我们选择了前20 的信号通路，绘制了如下所示的气泡图（图5）。最后，我们发现了6 条信号通路与胃癌的发病密切相关，“Pathway in cancer”是包含作用靶点最多的信号通路（72 个靶点），其网络如下所示（图6）。这些信号通路与细胞分化、增殖、凋亡和血管生成密切相关，其中大部分在癌症的发生和发展中起着关键作用。所发现的相关分子功能和生物过程也同样与胃癌的发生和发展密切相关，上述结果都表明脾胃培源方可以通过多个靶点和途径治疗胃癌。

图5 靶点基因的KEGG 分析结果一览图

图6 Pathway in Cancer 信号通路的网络图

5 分子对接实验的结果

分子对接实验通常被用来验证药物成分和其目标基因表达产物之间的相互作用情况。本研究中，相关药物有效成分与靶点基因表达产物的分子对接得分结果如表2 所示，分子对接实验结果的示意图如图7 所示。

图7 活性成分与目标基因表达产物的结合示意图

表2 分子对接实验结果得分表

从结果来看，Caspase-3 与山奈酚的最低结合自由能为-6.1 kcal/mol，Caspase-3 中的氨基酸片段THR62 和山奈酚之间存在一个氢键相互作用。Caspase-3 和luteolin 的最低结合自由能是-6.1 kcal/mol。其中氨基酸片段THR62、SER251 和木犀草素之间存在疏水相互作用。MAPK1 和木犀草素的最低结合自由能为-7.9 kcal/mol，其氨基酸片段LYS54、

GLN105、MET108、ASP167 和木犀草素之间存在疏水相互作用。Caspase-3 和槲皮素的最低结合自由能是-6.0 kcal/mol，其氨基酸片段THR62 和槲皮素之间有两个疏水键相互作用。MAPK1 和槲皮素的最低结合自由能是-8.1 kcal/mol，其氨基酸片段ASP106、MET108 和槲皮素之间有两个疏水键相互作用。所有的化合物都能与蛋白质的“活性口袋”紧密结合，这些相互作用使相关靶基因的表达产物能够与药物的主要成分形成稳定的复合体。在这项研究中，分子对接实验解释了蛋白质与化合物的相互作用方式，为进一步研究脾胃培源方治疗胃癌奠定了理论基础。

讨论

多项研究表明，传统的手术、放疗和化疗等治疗方法对胃癌的治疗效果不佳，然而中医治疗有其独特的自身优势，在提高身体免疫力和缓解胃癌引起的症状方面有很大潜力[19]。通过我们的研究发现，脾胃培源方具有多成分、多靶点、多途径的综合调节作用。基于181 个潜在靶点，通过分析得到6 个相关通路以及许多相关的生物学过程，从理论上讲，脾胃培源方对GC 的疗效是确切的。

我们发现，槲皮素、异鼠李素、木犀草素和山奈酚等是脾胃培源方发挥药理作用的主要成分，与细胞周期调节相关的蛋白在胃癌发病与进展中起重要作用。槲皮素是一种具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤作用的生物类黄酮，它已被证明可通过各种作用机制抑制胃癌细胞生长[20-22]。槲皮素可以通过MAPK、ERK、PI3K、PKC 等信号通路调节caspases 家族和Bcl-2 家族蛋白的表达，诱导细胞凋亡[23-26]。Shang HS 等人[27]发现，槲皮素可以通过引起细胞形态的变化来诱导AGS 细胞的凋亡，从而降低肿瘤细胞的整体存活率。山奈酚是广泛存在于蔬菜和水果中的一种重要的黄酮类化合物，它能诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡[28-30]。它已被证明可以抑制肿瘤细胞的增殖和转移。Yang L 等人[31]发现，山奈酚主要通过三个关键靶点治疗胃癌，即ESR1、EGFR 和SRC。EGFR 和SRC 的表达水平在胃癌组织中的表达有不同程度地升高，这些靶点的高表达直接影响了胃癌患者的预后生存率。

基于网络药理学的分析，脾胃培源方主要通过参与调节与癌症相关的信号通路来发挥治疗胃癌的作用。PI3K-Akt 信号通路是调节癌症发展过程中细胞增殖、分化和转移的关键通路[32]，激活的AKT 可以通过参与调节细胞蛋白表达而导致细胞凋亡，最终抑制细胞增殖[33]。已有研究表明，胃癌组织中P13K-AKT信号通路的异常表达与肿瘤的发展和预后密切相关，P13K-AKT 信号通路在调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移中起着重要作用。同时，P13K-AKT 信号通路在GC 中的高表达与肿瘤的分化程度有关，其表达水平与GC 的恶性程度呈正相关[34-36]。MAPK 信号通路几乎在所有真核生物中都有表达。它参与细胞的各种活动，如基因表达、细胞增殖和细胞凋亡，在细胞活动中起关键作用[37]。ERK 信号通路是MAPK 信号通路的一个重要组成部分，ERK 信号通路的基因突变或异常激活可导致癌症的发生[38]。Ras 是ERK/MAPK 信号通路上游的一个结合激酶，其点突变可导致ERK/MAPK 信号通路失调和细胞活动异常，进而导致癌细胞迁移和侵袭，最终诱发肿瘤的发生[39-40]。

综上，中药的活性成分、作用靶点是中药现代化研究的一个重要方面。网络药理学可以通过在基因、蛋白质和化合物之间构建网络，在复杂系统中寻找有效物质，为了解其作用机制提供有效信息。然而，网络药理学的方法也有一些局限性。一是检索数据库不够全面。二是部分成分和靶点仍缺乏研究支持。因此，需要进一步的实验验证结合网络药理学使用。

通过本文研究我们发现，脾胃培源方可通过PI3K-Akt 信号通路来抑制GC 的发生发展。尽管这一假设已初步得到证实，但还需要通过实验进一步研究验证，以评估脾胃培源方与PI3K-Akt 信号通路在治疗GC 中发挥的作用机制。