巴戟天—牛膝醇提物对SD大鼠软骨细胞G1/S周期蛋白与基因表达影响的实验研究

吴子健　吴桂玲　陈达婷　苏澜　陈春蓉　叶锦霞　洪振强

【摘 要】目的：探究巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培养的SD大鼠软骨细胞G1/S周期蛋白与mRNA含量表达的影响，为其防治骨关节炎的临床应用提供依据。方法：①用乙醇加热回流法获得其醇提物成分；采用机械-酶消化法分离SD大鼠膝关节处的关节软骨，建立体外培养细胞模型并进行鉴定；②MTT法检测M-AAE对软骨细胞增殖特性的影响，使用倒置相差显微镜镜下观察软骨细胞状态；③PCR、Western blot法分别检测体外培养大鼠软骨细胞经M-AAE的0，75，150，300 μg·mL-1 DMEM溶液干预48 h后的mRNA、蛋白含量的表达。结果：①软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色；②经MTT检测M-AAE对软骨细胞增殖具有一定的时效-量效关系，其最佳干预时间和浓度分别为48 h和150 μg·mL-1；③M-AAE干预软骨细胞后，各加药组细胞周期蛋白依赖性激酶-4（CDK4）、细胞周期蛋白D1 （Cyclin D1）的mRNA与蛋白含量的表达量均明显高于0 μg·mL-1组，其中以150 μg·mL-1组的表达量最高（P < 0.01），75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较，其表达量差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：M-AEE可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达，对SD大鼠软骨细胞具有一定的促增殖作用。

【关键词】 骨关节炎；巴戟天；牛膝；醇提物；软骨细胞；增殖；大鼠

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种临床常见的骨科退行性疾病，由于生物力学作用异常等叠加因素的影响，引起关节软骨代谢及修复功能失衡，进而加剧关节软骨退变，造成关节损害。临床表现常以关节反复性疼痛、肿胀、活动障碍为主。鉴于其发病周期长、致残率高等特点，对其防治具有重要现实意义[1-2]。目前，治疗OA的方法众多，大致可分保守治疗和手术治疗两大类。其中，保守治疗以药物为主，西医主要有口服和局部给药两种方式，前者因非甾体抗炎药等产生的胃肠道不良反应而使用受限，而后者可有感染危险且效果也非常有限；手术方法作为一种补救措施，因其并发症较多，影响因素复杂，且术后需要长时间康复，远期疗效有待进一步考证。中医药疗法治疗具有多靶点、疗效显著、副作用小、适合长期治疗等优势[3]。

当前，在中医药领域，补肝肾祛风湿法在防治OA上应用广泛，并成为该领域研究热点[4]。巴戟天、牛膝均具有补肝肾、祛风湿、强筋骨功效，是临床治疗OA常用配伍药。巴戟天、牛膝的联用可追溯到《备急千金要方》记载的巴戟天酒，其合用可增强补肾强筋、祛风除痹之效用，治疗肝肾亏虚型骨痹具有良性作用；另外源自《太平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝组方。因此，本研究旨在观察药对巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培养大鼠软骨细胞周期蛋白与基因的影响，进而为其阐明防治OA的治疗机制及临床运用提供实验支持。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠16只，体质量90～100 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK2012-0001（闽）。

1.2 实验药物 中药材巴戟天和牛膝，均由福州回春中药饮片有限公司提供。

1.3 主要试剂 磷酸盐缓冲液（HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技术有限公司）；RT-PCR引物合成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；TRIZOL（美国life）；异丙醇（国药集团药业股份有限公司）；无水乙醇（国药集团药业股份有限公司）；琼脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；WB玻板（美国BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制剂）；RISF（裂解液）、蛋白上样缓冲液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效显影液（Thermo）；质量分数为30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸钠）、10×电泳液、AP（过硫酸铵）、TEMED、50×TAE（碧云天生物技术研究所）；10×TBST（Solarbio）；高效封闭液（北京康为世纪生物科技有限公司）；一抗（兔抗）、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody（C-22，美国Santa Cruz Biotechnology）；二抗（羊抗兔，美国CST）等。

1.4 主要仪器 DNA扩增仪（9600型，美国PE）；低温高速离心机（64R型，美国BECKMAN）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；超纯水装置（MILLI-Q型，美国MILIPORE）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本TKO）；无菌操作台（AIRTECH型）、超净工作台（SW-CJ-1F型）（苏州安泰空气技术有限公司）；凝胶成像系统（GELDOC2000型，美国BIO-RAD）；全自动酶标仪（BIO-TEK ELX800型，美国BIO-Tek）；CO2恒温培养箱（BB16/BB5060型，德国Heraus）等。

2 方 法

2.1 M-AAE的提取 称取巴戟天、牛膝各100 g，依次经粉碎、筛检后移入装有500 mL质量分数为50%乙醇的烧瓶中浸渍7 d，收集上清液；再加入500 mL质量分数为50%乙醇，依法浸渍7 d，再次收集上清液；第3次加入500 mL质量分数为50%乙醇，继续浸渍7 d后收集上清液，最后合并3次浸出液，静置24 h，过滤，浓缩，回旋蒸发乙醇，97 ℃水浴锅持续蒸干水分，即得M-AEE提物浸膏。后置于烘干箱繼续蒸干，待低温下研磨成粉末状。实验用时进行精确称量，并使用DMEM在低频超声下溶解，再经0.22 μL无菌滤嘴滤过后4 ℃冰箱保存备用。

2.2 软骨细胞的分离、培养与鉴定 在麻醉状态下进行脱颈椎处死SD大鼠，每次3只，分离膝关节处关节软骨。收集并剪碎至1 mm3/单位体积，PBS缓冲液冲洗至少3次后移至无菌小培养皿中，按每个器皿2.5 mL的体积加入质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶进行消化，15 mL离心管收集消化后的上清液（每次2 h），1500 r·min-1离心机离心后弃上清液，移液器代液（含质量分数为10%胎牛血清DMEM）状态缓慢吹匀沉淀。经计数板计数（2×105·mL-1）后种植原代软骨细胞于培养瓶进行培养，48 h后初次换液。镜下观察细胞铺满80%瓶底面积时，经胰酶消化进行细胞传代。本实验使用第2代软骨细胞[5]。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：软骨细胞（经计数每毫升2500个）待爬片后，经PBS冲洗3次，质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min。再经冲洗、裂解（质量分数为0.1%的破膜剂50 μL）20 min，冲洗后加入50 μL质量分数为3%的H2O2反应

20 min。再次冲洗后经5% BSA封闭30 min，设置阳性对照组、阴性对照组。阳性对照组加入含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反应过夜，阴性对照组加入PBS作为对照。后经PBS冲洗3遍后加入50 μL二抗（1∶200）反应30 min，再次冲洗后以每张玻片50 μL DAB进行浸润10 min。再依次经过漂洗、苏木素复染、冲洗（PBS）、返蓝2 s、常温晾干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与透明后封片观察[6]。

2.3 MTT测定M-AAE干预后软骨细胞增殖活性

以96孔板为载体培育经计数为每孔2×103的第

2代软骨细胞24 h后，再饥饿细胞同步培养24 h，

弃去旧液更换含质量分数为10%的胎牛血清DMEM培养，标记分组后依次加入0，75，150，300，600 μg·mL-1浓度的M-AEE分别培养24，48，72 h。后续操作依次为：弃净每孔旧液、

37 ?C温箱MTT（每孔100 μL）反应5 h、二甲基亚砜（DMSO）振荡条件下反应10 min（每孔100 μL）、

酶标仪570 nm波长下检测每孔OD值、记录与分析。

2.4 M-AEE干预软骨细胞活性镜下观察 软骨细胞的分离和培养，选取实验所需细胞，经0，75，150，300 μg·mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干预48 h后，使用光镜观察。

2.5 RT-PCR法检测CDK4、Cyclin D1 mRNA表达

2.5.1 CDK4、Cyclin D1 mRNA引物设计与合成见表1。

2.5.2 RT-PCR方法 使用核酸蛋白检测仪检测所提Total RNA浓度，当A260/A280比值在1.8～

2.0时，表明本实验所提取的软骨细胞Total RNA纯度较高。然后进行RNA逆转录反应，制备质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶。成胶后取出浸入电泳槽，加TAE（1×）电泳缓冲液，排除气泡。取上述各组RNA 每孔5 μL、Marker 每孔4.5 μL，电泳条件为100 V、70 mA、15 min，使用BIO-RAD Fluor-S TM Multi Imager图象分析仪下扫描，经分析后拍照存档。

2.6 Western Blot检测CDK4、Cyclin D1蛋白含量 设置分组（0，75，150，300 μg·mL-1组），经M-AAE干预48 h后，依次经PBS冲洗后吸净、加入裂解液（含100∶1蛋白酶抑制剂PMSF）、收集经刮刀刮取的细胞后离心取上清进行蛋白提取，参照碧云天生物技术研究所生产的BCA蛋白浓度检测试剂盒说明进行定量；制备质量分数为12%分离胶与质量分数为5%浓缩胶进行灌板，按每孔50 μg量計算上样体积后依次加入，蛋白Marker加入每孔5 μL，在恒流下以20 V电压先跑10 min，再调整到100 V电压跑至分离胶底部进行电泳；调整电流为1.3 A、电压25 V，本实验中以β-actin耗时为7 min、CDK4为5 min、Cyclin D1为5 min进行半干式转膜，再经TBST中漂洗、封闭、洗膜、一抗过夜（1∶1000浓度的β-actin、CDK4、Cyclin D1）、TBST漂洗、二抗（1∶5000）封闭后洗膜进行显影。

2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验和单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞观察与鉴定 第2代软骨细胞镜下观察：分布均匀，边界清晰，形态结构一致，呈明显的铺路石状外观；经Ⅱ型胶原免疫组化染色后，阳性对照组胞浆区为棕黄色，阴性对照组胞浆区颜色透明。以上可鉴定本实验所用细胞为软骨细胞。见图1。

3.2 M-AEE对软骨细胞增殖的时效与量效关系 用MTT法检测M-AAE在不同浓度（0，75，150，300，600 μg·mL-1）及不同时间（24，48，72 h）对软骨细胞增殖特性的影响。与0 μg·mL-1组比较，24，48，72 h的OD值均有升高，其中以48 h与150 μg·mL-1条件下软骨细胞增殖明显，差异有统计学意义（P < 0.01）。进而推测M-AAE干预软骨细胞后，对其增殖具有一定的时效-量效关系。其最佳干预时间和浓度分别为48 h和

150 μg·mL-1。见表2。

3.3 M-AEE干预软骨细胞活性镜下观察 经0，75，150，300 μg·mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干预48 h后，行光镜下观察：0 μg·mL-1浓度下观察细胞外观形似扁平状，胞浆丰富，胞核清晰，具有1～2个核仁，细胞数目较少，见图2（1）；经75 μg·mL-1浓度干预后，细胞分布均匀，大部为扁平状、细胞状态较好且细胞数量较多，见图2（2）；经150 μg·mL-1浓度干预后，软骨细胞紧贴聚集生长，外观以扁平状为主，边界清晰，形态结构一致，细胞核清晰、饱满，细胞状态佳，细胞数目最多，见图2（3）；经300 μg·mL-1浓度干预后，细胞数目较多但细胞核不规则，培养基中漂浮细胞较多，细胞状态欠佳，见图2（4）。

3.4 RT-PCR检测结果 M-AAE干预软骨细胞后，各加药组CDK4、ClinD1的mRNA的表达量均明显高于0 μg·mL-1组，其中以150 μg·mL-1组的表达量最高（P < 0.01）。75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1

组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较，其表达量差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

3.5 Western blot检测结果 M-AAE干预软骨细胞后，各加药组CDK4、ClinD1蛋白表达量明显高于0 μg·mL-1组，其中以150 μg·mL-1组的表达量最高（P < 0.01）。75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1

组相比，在Cyclin D1和CDK4指标上，其蛋白含量的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

4 讨 论

OA属中医学“骨痹”范畴，其病机主要在于“天癸竭，形体衰”导致肝肾亏虚，进而加剧筋骨失养，最终表现为关节不利、疼痛缠绵。基于“肾主骨、肝主筋”“肝肾同源”理论，肾精充足则肝血充盈，肝血得到濡养则能化精，肾精方可充满，由此可见，肾中精气的气化与肝血的化生存在互生互利的密切联系。鉴于OA的病位在“肝肾”而外现于“筋骨”，故通过补肝肾、祛风湿法使经络通达，则肝肾精华得以濡养筋骨，从而驱逐滞留关节外邪，以达通利关节之效[7]。巴戟天、牛膝则以其补肝肾、祛风湿的作用整体切合OA的病机。现代药理研究发现，巴戟天主要化学成分有糖类、蒽醌类、环烯醚萜苷类、有机酸类、微量元素、氨基酸和甾醇类等，具有改善机体免疫功能、抗氧化、强壮骨骼、抗炎镇痛补血及促进造血干细胞增殖和分化等作用[8-10]。牛膝作为临床治疗OA常用药物，可引经下行，治疗OA发挥重要作用，研究表明，其主要成分有皂苷、脱皮甾酮、牛膝甾酮及糖类物质，并具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血等作用[11-13]。

鉴于细胞活力与细胞数呈正相关性，本实验首先运用MTT比色法检测狗脊多糖在不同浓度下对体外培养SD大鼠软骨细胞活性作用的影响，结果显示，M-AAE对软骨细胞增殖的影响与其药物浓度和时间有关，其最佳时效-量效关系为48 h和150 μg·mL-1；软骨细胞可发生有丝分裂，产生子代软骨细胞，以此维持关节功能趋于稳定。鉴于细胞有丝分裂的表现形式类似圆周循环，即具有周期性，通常称之为细胞周期，而对其调控发挥主要作用的内源性途径主要由细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）等组成，两者的协同作用可直接推动骨细胞跨越位于DNA合成起始部的G1/S

周期，进而决定细胞分裂，从而影响细胞增殖结果[14-15]。故本研究基于G1/S周期的CDK4、Cyclin D1的正性调节作用，初步探讨M-AAE对体外培养大鼠软骨细胞的影响，结果发现，与0 μg·mL-1组相比，M-AAE在一定条件下可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。进而提示M-AAE可通过促进软骨细胞G1/S期的转变，加速细胞分裂，对软骨细胞增殖具有正性调控作用，从而为其在临床应用于OA提供相关依据。

5 参考文献

[1] Li X，Zhen Z，Tang G，et al.MiR-29a and MiR-140 Protect Chondrocytes against the Anti-Proliferation and Cell Matrix Signaling Changes by IL-1β[J].Mol Cells，2016，39（2）：103-110.

[2] 梅阳阳，付长龙，庞书勤，等.乌头汤药理药效研究及其干预骨关节炎的机制探讨[J].风湿病与关节炎，2016，5（6）：47-50.

[3] 刘献祥.基于陈可冀学术思想之骨性关节炎研究[J].康复学报，2016，26（1）：2-5.

[4] 袁芳，侯秀娟，刘小平，等.补益肝肾活血通络法治疗膝骨关节炎的理论探讨[J].中华中医药杂志，2016，31（3）：891-893.

[5] 付长龙，潘彩斌，刘国强，等.药对巴戟天-杜仲总多糖的含量测定及其对大鼠软骨细胞增殖的影响[J].

风湿病与关节炎，2014，3（6）：23-26.

[6] Liu F，Liu G，Liang W，et al.Duhuo Jisheng decoction treatment inhibits the sodium nitroprussiate-induced apoptosis of chondrocytes through the mitochondrial-dependent signaling pathway[J].Int J Mol Med，2014，34（6）：1573-1580.

[7] Chen WH，Liu XX，Tong PJ，et al.Diagnosis and management of knee osteoarthritis：Chinese medicine expert consensus（2015）[J].Chin J Integr Med，2016，22（2）：150-153.

[8] 鄭素玉，陈健.巴戟天有效成分及其药理作用实验研究进展[J].世界中西医结合杂志，2012，7（9）：823-825，828.

[9] 史辑，崔妮，贾天柱.巴戟天不同炮制品及提取部位抗大鼠佐剂性关节炎的比较研究[J].中药材，2015，38（8）：1626-1629.

[10] 黄涛，张钢林，李楠.巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞凋亡的影响[J].北京体育大学学报，2010，33（8）：56-61.

[11] 黄丽婵，杨世奎，刘发元，等.川牛膝、怀牛膝治疗骨关节炎的药效物质基础探讨[J].风湿病与关节炎，2014，3（11）：52-54.

[12] 林平冬，翁霞萍，刘发元，等.牛膝有效成分防治骨关节炎的作用机制探讨[J].风湿病与关节炎，2015，4（2）：56-59.

[13] 刘发元，党传鹏，翁霞萍，等.牛膝引药下行靶向调节骨关节炎软骨退变的机制探讨[J].风湿病与关节炎，2014，3（6）：46-48.

[14] Wu G，Fan H，Huang Y，et al.Duhuo Jisheng Decoction-containing serum promotes proliferation of interleukin-1β-induced chondrocytes through the p16-cyclin D1/CDK4-Rb pathway[J].Mol Med Rep，2014，10（5）：2525-2534.

[15] Yu FR，Li X，Cai L，et al.Achyranthes bidentata polysaccharides induce chondrocyte proliferation via the promotion of the G1/S cell cycle transition[J].Mol Med Rep，2013，7（3）：935-940.

收稿日期：2016-10-10；修回日期：2016-11-30