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巴戟天—牛膝醇提物对SD大鼠软骨细胞G1/S周期蛋白与基因表达影响的实验研究

2017-03-14吴子健吴桂玲陈达婷苏澜陈春蓉

风湿病与关节炎 2017年2期
关键词:牛膝增殖骨关节炎

吴子健 吴桂玲 陈达婷 苏澜 陈春蓉 叶锦霞 洪振强

【摘 要】目的:探究巴戟天-牛膝醇提物(M-AAE)对体外培养的SD大鼠软骨细胞G1/S周期蛋白与mRNA含量表达的影响,为其防治骨关节炎的临床应用提供依据。方法:①用乙醇加热回流法获得其醇提物成分;采用机械-酶消化法分离SD大鼠膝关节处的关节软骨,建立体外培养细胞模型并进行鉴定;②MTT法检测M-AAE对软骨细胞增殖特性的影响,使用倒置相差显微镜镜下观察软骨细胞状态;③PCR、Western blot法分别检测体外培养大鼠软骨细胞经M-AAE的0,75,150,300 μg·mL-1 DMEM溶液干预48 h后的mRNA、蛋白含量的表达。结果:①软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后,阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色;②经MTT检测M-AAE对软骨细胞增殖具有一定的时效-量效关系,其最佳干预时间和浓度分别为48 h和150 μg·mL-1;③M-AAE干预软骨细胞后,各加药组细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)、细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)的mRNA与蛋白含量的表达量均明显高于0 μg·mL-1组,其中以150 μg·mL-1组的表达量最高(P < 0.01),75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较,其表达量差异无统计学意义(P > 0.05)。结论:M-AEE可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达,对SD大鼠软骨细胞具有一定的促增殖作用。

【关键词】 骨关节炎;巴戟天;牛膝;醇提物;软骨细胞;增殖;大鼠

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种临床常见的骨科退行性疾病,由于生物力学作用异常等叠加因素的影响,引起关节软骨代谢及修复功能失衡,进而加剧关节软骨退变,造成关节损害。临床表现常以关节反复性疼痛、肿胀、活动障碍为主。鉴于其发病周期长、致残率高等特点,对其防治具有重要现实意义[1-2]。目前,治疗OA的方法众多,大致可分保守治疗和手术治疗两大类。其中,保守治疗以药物为主,西医主要有口服和局部给药两种方式,前者因非甾体抗炎药等产生的胃肠道不良反应而使用受限,而后者可有感染危险且效果也非常有限;手术方法作为一种补救措施,因其并发症较多,影响因素复杂,且术后需要长时间康复,远期疗效有待进一步考证。中医药疗法治疗具有多靶点、疗效显著、副作用小、适合长期治疗等优势[3]。

当前,在中医药领域,补肝肾祛风湿法在防治OA上应用广泛,并成为该领域研究热点[4]。巴戟天、牛膝均具有补肝肾、祛风湿、强筋骨功效,是临床治疗OA常用配伍药。巴戟天、牛膝的联用可追溯到《备急千金要方》记载的巴戟天酒,其合用可增强补肾强筋、祛风除痹之效用,治疗肝肾亏虚型骨痹具有良性作用;另外源自《太平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝组方。因此,本研究旨在观察药对巴戟天-牛膝醇提物(M-AAE)对体外培养大鼠软骨细胞周期蛋白与基因的影响,进而为其阐明防治OA的治疗机制及临床运用提供实验支持。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠16只,体质量90~100 g,由福建中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK2012-0001(闽)。

1.2 实验药物 中药材巴戟天和牛膝,均由福州回春中药饮片有限公司提供。

1.3 主要试剂 磷酸盐缓冲液(HyClone);DMEM/LOW GLUCOSE(HyClone);逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ(北京全式金生物技术有限公司);RT-PCR引物合成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物(上海捷瑞生物工程有限公司);TRIZOL(美国life);异丙醇(国药集团药业股份有限公司);无水乙醇(国药集团药业股份有限公司);琼脂糖(Biowest Agarose);核酸染料(Solarbio);WB玻板(美国BIO-RAD);PMSF(蛋白酶抑制剂);RISF(裂解液)、蛋白上样缓冲液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效显影液(Thermo);质量分数为30%的聚丙烯酰胺、Tris(pH = 8.8与pH = 6.8)、SDS(十二烷基磺酸钠)、10×电泳液、AP(过硫酸铵)、TEMED、50×TAE(碧云天生物技术研究所);10×TBST(Solarbio);高效封闭液(北京康为世纪生物科技有限公司);一抗(兔抗)、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody(C-22,美国Santa Cruz Biotechnology);二抗(羊抗兔,美国CST)等。

1.4 主要仪器 DNA扩增仪(9600型,美国PE);低温高速离心机(64R型,美国BECKMAN);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);超纯水装置(MILLI-Q型,美国MILIPORE);荧光倒置相差显微镜(Olympus,日本TKO);无菌操作台(AIRTECH型)、超净工作台(SW-CJ-1F型)(苏州安泰空气技术有限公司);凝胶成像系统(GELDOC2000型,美国BIO-RAD);全自动酶标仪(BIO-TEK ELX800型,美国BIO-Tek);CO2恒温培养箱(BB16/BB5060型,德国Heraus)等。

2 方 法

2.1 M-AAE的提取 称取巴戟天、牛膝各100 g,依次经粉碎、筛检后移入装有500 mL质量分数为50%乙醇的烧瓶中浸渍7 d,收集上清液;再加入500 mL质量分数为50%乙醇,依法浸渍7 d,再次收集上清液;第3次加入500 mL质量分数为50%乙醇,继续浸渍7 d后收集上清液,最后合并3次浸出液,静置24 h,过滤,浓缩,回旋蒸发乙醇,97 ℃水浴锅持续蒸干水分,即得M-AEE提物浸膏。后置于烘干箱繼续蒸干,待低温下研磨成粉末状。实验用时进行精确称量,并使用DMEM在低频超声下溶解,再经0.22 μL无菌滤嘴滤过后4 ℃冰箱保存备用。

2.2 软骨细胞的分离、培养与鉴定 在麻醉状态下进行脱颈椎处死SD大鼠,每次3只,分离膝关节处关节软骨。收集并剪碎至1 mm3/单位体积,PBS缓冲液冲洗至少3次后移至无菌小培养皿中,按每个器皿2.5 mL的体积加入质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶进行消化,15 mL离心管收集消化后的上清液(每次2 h),1500 r·min-1离心机离心后弃上清液,移液器代液(含质量分数为10%胎牛血清DMEM)状态缓慢吹匀沉淀。经计数板计数(2×105·mL-1)后种植原代软骨细胞于培养瓶进行培养,48 h后初次换液。镜下观察细胞铺满80%瓶底面积时,经胰酶消化进行细胞传代。本实验使用第2代软骨细胞[5]。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:软骨细胞(经计数每毫升2500个)待爬片后,经PBS冲洗3次,质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min。再经冲洗、裂解(质量分数为0.1%的破膜剂50 μL)20 min,冲洗后加入50 μL质量分数为3%的H2O2反应

20 min。再次冲洗后经5% BSA封闭30 min,设置阳性对照组、阴性对照组。阳性对照组加入含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反应过夜,阴性对照组加入PBS作为对照。后经PBS冲洗3遍后加入50 μL二抗(1∶200)反应30 min,再次冲洗后以每张玻片50 μL DAB进行浸润10 min。再依次经过漂洗、苏木素复染、冲洗(PBS)、返蓝2 s、常温晾干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与透明后封片观察[6]。

2.3 MTT测定M-AAE干预后软骨细胞增殖活性

以96孔板为载体培育经计数为每孔2×103的第

2代软骨细胞24 h后,再饥饿细胞同步培养24 h,

弃去旧液更换含质量分数为10%的胎牛血清DMEM培养,标记分组后依次加入0,75,150,300,600 μg·mL-1浓度的M-AEE分别培养24,48,72 h。后续操作依次为:弃净每孔旧液、

37 ?C温箱MTT(每孔100 μL)反应5 h、二甲基亚砜(DMSO)振荡条件下反应10 min(每孔100 μL)、

酶标仪570 nm波长下检测每孔OD值、记录与分析。

2.4 M-AEE干预软骨细胞活性镜下观察 软骨细胞的分离和培养,选取实验所需细胞,经0,75,150,300 μg·mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干预48 h后,使用光镜观察。

2.5 RT-PCR法检测CDK4、Cyclin D1 mRNA表达

2.5.1 CDK4、Cyclin D1 mRNA引物设计与合成见表1。

2.5.2 RT-PCR方法 使用核酸蛋白检测仪检测所提Total RNA浓度,当A260/A280比值在1.8~

2.0时,表明本实验所提取的软骨细胞Total RNA纯度较高。然后进行RNA逆转录反应,制备质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶。成胶后取出浸入电泳槽,加TAE(1×)电泳缓冲液,排除气泡。取上述各组RNA 每孔5 μL、Marker 每孔4.5 μL,电泳条件为100 V、70 mA、15 min,使用BIO-RAD Fluor-S TM Multi Imager图象分析仪下扫描,经分析后拍照存档。

2.6 Western Blot检测CDK4、Cyclin D1蛋白含量 设置分组(0,75,150,300 μg·mL-1组),经M-AAE干预48 h后,依次经PBS冲洗后吸净、加入裂解液(含100∶1蛋白酶抑制剂PMSF)、收集经刮刀刮取的细胞后离心取上清进行蛋白提取,参照碧云天生物技术研究所生产的BCA蛋白浓度检测试剂盒说明进行定量;制备质量分数为12%分离胶与质量分数为5%浓缩胶进行灌板,按每孔50 μg量計算上样体积后依次加入,蛋白Marker加入每孔5 μL,在恒流下以20 V电压先跑10 min,再调整到100 V电压跑至分离胶底部进行电泳;调整电流为1.3 A、电压25 V,本实验中以β-actin耗时为7 min、CDK4为5 min、Cyclin D1为5 min进行半干式转膜,再经TBST中漂洗、封闭、洗膜、一抗过夜(1∶1000浓度的β-actin、CDK4、Cyclin D1)、TBST漂洗、二抗(1∶5000)封闭后洗膜进行显影。

2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示,采用t检验和单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞观察与鉴定 第2代软骨细胞镜下观察:分布均匀,边界清晰,形态结构一致,呈明显的铺路石状外观;经Ⅱ型胶原免疫组化染色后,阳性对照组胞浆区为棕黄色,阴性对照组胞浆区颜色透明。以上可鉴定本实验所用细胞为软骨细胞。见图1。

3.2 M-AEE对软骨细胞增殖的时效与量效关系 用MTT法检测M-AAE在不同浓度(0,75,150,300,600 μg·mL-1)及不同时间(24,48,72 h)对软骨细胞增殖特性的影响。与0 μg·mL-1组比较,24,48,72 h的OD值均有升高,其中以48 h与150 μg·mL-1条件下软骨细胞增殖明显,差异有统计学意义(P < 0.01)。进而推测M-AAE干预软骨细胞后,对其增殖具有一定的时效-量效关系。其最佳干预时间和浓度分别为48 h和

150 μg·mL-1。见表2。

3.3 M-AEE干预软骨细胞活性镜下观察 经0,75,150,300 μg·mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干预48 h后,行光镜下观察:0 μg·mL-1浓度下观察细胞外观形似扁平状,胞浆丰富,胞核清晰,具有1~2个核仁,细胞数目较少,见图2(1);经75 μg·mL-1浓度干预后,细胞分布均匀,大部为扁平状、细胞状态较好且细胞数量较多,见图2(2);经150 μg·mL-1浓度干预后,软骨细胞紧贴聚集生长,外观以扁平状为主,边界清晰,形态结构一致,细胞核清晰、饱满,细胞状态佳,细胞数目最多,见图2(3);经300 μg·mL-1浓度干预后,细胞数目较多但细胞核不规则,培养基中漂浮细胞较多,细胞状态欠佳,见图2(4)。

3.4 RT-PCR检测结果 M-AAE干预软骨细胞后,各加药组CDK4、ClinD1的mRNA的表达量均明显高于0 μg·mL-1组,其中以150 μg·mL-1组的表达量最高(P < 0.01)。75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1

组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较,其表达量差异均无统计学意义(P > 0.05)。见图3。

3.5 Western blot检测结果 M-AAE干预软骨细胞后,各加药组CDK4、ClinD1蛋白表达量明显高于0 μg·mL-1组,其中以150 μg·mL-1组的表达量最高(P < 0.01)。75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1

组相比,在Cyclin D1和CDK4指标上,其蛋白含量的表达差异无统计学意义(P > 0.05)。见图4。

4 讨 论

OA属中医学“骨痹”范畴,其病机主要在于“天癸竭,形体衰”导致肝肾亏虚,进而加剧筋骨失养,最终表现为关节不利、疼痛缠绵。基于“肾主骨、肝主筋”“肝肾同源”理论,肾精充足则肝血充盈,肝血得到濡养则能化精,肾精方可充满,由此可见,肾中精气的气化与肝血的化生存在互生互利的密切联系。鉴于OA的病位在“肝肾”而外现于“筋骨”,故通过补肝肾、祛风湿法使经络通达,则肝肾精华得以濡养筋骨,从而驱逐滞留关节外邪,以达通利关节之效[7]。巴戟天、牛膝则以其补肝肾、祛风湿的作用整体切合OA的病机。现代药理研究发现,巴戟天主要化学成分有糖类、蒽醌类、环烯醚萜苷类、有机酸类、微量元素、氨基酸和甾醇类等,具有改善机体免疫功能、抗氧化、强壮骨骼、抗炎镇痛补血及促进造血干细胞增殖和分化等作用[8-10]。牛膝作为临床治疗OA常用药物,可引经下行,治疗OA发挥重要作用,研究表明,其主要成分有皂苷、脱皮甾酮、牛膝甾酮及糖类物质,并具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血等作用[11-13]。

鉴于细胞活力与细胞数呈正相关性,本实验首先运用MTT比色法检测狗脊多糖在不同浓度下对体外培养SD大鼠软骨细胞活性作用的影响,结果显示,M-AAE对软骨细胞增殖的影响与其药物浓度和时间有关,其最佳时效-量效关系为48 h和150 μg·mL-1;软骨细胞可发生有丝分裂,产生子代软骨细胞,以此维持关节功能趋于稳定。鉴于细胞有丝分裂的表现形式类似圆周循环,即具有周期性,通常称之为细胞周期,而对其调控发挥主要作用的内源性途径主要由细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)等组成,两者的协同作用可直接推动骨细胞跨越位于DNA合成起始部的G1/S

周期,进而决定细胞分裂,从而影响细胞增殖结果[14-15]。故本研究基于G1/S周期的CDK4、Cyclin D1的正性调节作用,初步探讨M-AAE对体外培养大鼠软骨细胞的影响,结果发现,与0 μg·mL-1组相比,M-AAE在一定条件下可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。进而提示M-AAE可通过促进软骨细胞G1/S期的转变,加速细胞分裂,对软骨细胞增殖具有正性调控作用,从而为其在临床应用于OA提供相关依据。

5 参考文献

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收稿日期:2016-10-10;修回日期:2016-11-30

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