补肾安胎冲剂治疗复发性流产的潜在分子机制*

侯阿美，储继军，汪小莉，郭锦晨

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038 2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

复 发 性 流 产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一种病因复杂的生殖疾患，一般是指妊娠28周之前发生胎儿丢失的次数≥3 次的，近年来该病发病率呈增长趋势，约占育龄期女性妊娠的1%～5%，严重威胁着女性身心健康[1]。现代研究普遍认为其病因主要与遗传、免疫、血栓前状态、内分泌及解剖异常等因素有关，且有约50%的患者不能确定为上述病因，称为不明原因复发性流产（URSA）[2]。目前西医对于RSA 患者妊娠早期主要以外源性孕激素+绒促性素的联合方案进行常规保胎治疗为主，但整体效果欠佳[3]。

补肾安胎冲剂是安徽中医药大学第一附属医院的特色制剂，多用于治疗自然流产、先兆流产及RSA患者，临床疗效颇为显著。方中以菟丝子（Cuscutae Semen，CS）、党参（Codonopsis Radix，CR）为君药，菟丝子补肾益精，肾旺自可荫胎，党参功可补气益血，又能健脾生津。熟地黄（Rehmanniae Radix Praeparata，RR）补肾填精益髓，加强补肾之功；续断（Dipsaci Radix，DR）为安胎之要药，合桑寄生（Herba Taxilli，HT）以补肝肾，强筋骨，固冲任；白术（Atractylodes Macrocephala Koidz，AM）、 黄 芪（Hedysarum Multijugum Maxim，HM）益气健脾，脾旺则气血充得以滋养先天，肾气充则胎元固摄有权，以上共为臣药。白芍（Paeoniae Radix Alba，PR）有养血调经、敛阴柔肝之功；黄芩（Scutellariae Radix，SR）清热燥湿，止血，安胎；旱莲草（Ecliptae Herba，EH）可凉血止血，补益肝肾；苎麻根（Boehmeriae Rhizoma Et Radix，BR）功可清热安胎，以防滋阴过于滋腻太过，为佐使药。全方共奏补肾健脾益气、清热养血安胎之功。

前期临床研究证实，补肾安胎冲剂对于RSA 患者具有十分显著的疗效[4]。在此基础上，课题组致力于其作用的机理研究，发现其作用机制可能与调控VEGFR-2/RAS/MAPK 信 号 通 路[5]、TGF-β1/PI3K/AKT 信号通路[6]、MAPK[7]、VEGF[8]、TNF-α[9]等有关。

网络药理学及分子对接技术是现代中药复方研究领域中的常用工具，能够深入研究中药药效的作用基础及环节，评价受体和药物分子亲和关系[10]。课题组基于前期研究，将网络药理学与分子对接技术联合起来，旨在进一步探索、验证补肾安胎冲剂治疗RSA的潜在靶标及作用通路，探索补肾安胎冲剂治疗RSA的分子作用机制，为其临床用药提供科学依据。

资料与方法

1 补肾安胎冲剂药物活性成分及作用靶点的筛选

在TCMSP 数 据 库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索补肾安胎冲剂中各药物的成分及靶点，通过设置口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 进一步筛选方中各药的活性成分。通过蛋白质Uniprot 数据库（http：//www.uniprot.org/）对各个靶点对应的基因进行校正并获得标准化的名称简写（Symbol）。

2 RSA 相关靶点的筛选

将“recurrent spontaneous abortion”“spontaneous abortion”等作为关键词，分别在Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、GeneBank（https：//cipotato.org/genebankcip/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）等数据库中检索并获取与RSA 相关的靶基因。再将所获全部基因进行合并、去除重复项及假阳性，获得RSA 疾病靶点基因的数据集。

3 中药复方网络构建及分析

通过Uniprot 数据库对RSA 相关靶点进行基因注释，并将药物相关靶点与RSA 相关靶点交集，获取交集靶点，并以Venn 图展示。通过在Cytoscape 3.8.2软件中导入药物活性成分及相应靶基因、疾病靶点信息，构建并绘制药物与RSA 的“药物-化合物-靶点-疾病”的调控网络图，展示补肾安胎冲剂中活性成分与RSA 疾病基因的相关性大小。

4 蛋白互作网络（PPI 网络）的构建

将1.3 中获得的交集靶点导入STRING 数据库（http：//www.string-db.org/）建立PPI 网络。再将所获取的信息导入Cytoscape 3.8.2 软件中，根据度值（Degree）进行精简分析，构建PPI 核心网络。

5 GO 功能富集分析与KEGG 通路分析：

将基因简写（Symbo1）转化为基因ID（EntrezID）后，再通过David 数据库及R 软件对关键靶点进行GO 功能富集及KEGG 通路分析，并绘制相关通路图。

6 分子对接验证

从有机小分子药物活性数据库（PubChem）中获取PPI 核心网络中补肾安胎冲剂对RSA 相关靶点活性成分2D 结构，并通过ChemBio3DUltra14.0 软件将2D 结构转换成3D 结构，构建小分子配体数据库。再运用PyMOL 生信软件对核心蛋白受体结构进行去除水分子、无效小分子配体等处理。最后运用Vina 进行分子对接，获得补肾安胎冲剂中活性分子与受体蛋白的结合关系和结合位置。

结果

1 补肾安胎冲剂活性成分的筛选

在TCMSP 数据库中设置OB ≥30%，DL ≥0.18，检索到化合物：菟丝子11 个、桑寄生2 个、续断8 个、党参21 个、白术7 个、黄芪20 个、黄芩36 个、白芍13个、熟地黄2 个、苎麻根5 个、旱莲草10 个。删除重复化合物和无对应靶点的化合物，共获得110 个活性成分，部分活性成分见表1。

表1 补肾安胎冲剂部分活性成分信息

2 RSA 疾病基因的筛选

在 G e n e c a r d s、O M I M、T T D、G e n e B a n k、PharmGkb 等 数 据 库 中，以“recurrent spontaneous abortion”“spontaneous abortion”等作为关键词，检索获取RSA 相关的靶基因。将检索到的靶基因经过取并集去重复等处理后，共得到2197 个RSA 相关基因靶点，绘制Venn 图见图1。

图1 RSA 疾病基因

3 中药复方网络构建及分析

通过Uniprot 数据库对疾病相关靶点进行基因注释，将药物相关靶点、疾病相关靶点取交集，获取补肾安胎冲剂与RSA 的交集靶点共102 个，包括AKT1、CCND1、MAPK14、TP53 等，并以Venn 图展示（图2）。利用Cytoscape 3.8.2 构建补肾安胎冲剂治疗RSA 的调控网络图（图3），共涉及81 种活性成分及102 个潜在靶点。其中圆饼图代表中药成分，不同颜色代表不同的中药，蓝色矩形则代表交集靶点。运用CytoNCA工具分析网络节点特征参数值，挖掘出中药作用的核心成分，如槲皮素、木犀草素、山奈酚等。

图2 补肾安胎冲剂与RSA 的交集靶点Venn 图

图3 补肾安胎冲剂治疗RSA 的调控网络图

4 PPI 网络构建

通过STRING 数据库构建PPI 网络，共得到102 个 节 点，1510 条 边。 将 结果 导 入Cytoscape 3.8.2 进行筛选，共得到28 个关键靶点，291 条边，以“Degree”“Betweenness”“Closeness”中 位 值 逐 步筛选，可得到6 个核心靶点，分别为AKT1、CCND1、MAPK14、TP53、JUN、ESR1，如图3 所示，这些靶点可视为补肾安胎冲剂治疗RSA 的关键靶点。

5 GO 功能富集分析及KEGG 通路分析

通过DAVID 数据库对102 个共同靶点进行GO功能富集分析，共获得GO 条目1942 条（P＜0.05），其中BP 条目1762 个，CC 条目32 个，MF 条目148 个，各组分排名前10 的条目见图5。结果表明，补肾安胎冲剂参与的生物学过程主要集中在血红素的结合、RNA 聚合酶转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合及氧化还原酶活性等。

图5 补肾安胎冲剂与RSA 交集基因GO 富集分析

KEGG 通路分析共得到157 条信号通路（P＜0.05），主要包括PI3K-AKT 信号通路、内分泌抵抗、AGE-RAGE 信号通路、p53 信号通路等，前30 条信号通路见图6。

图6 补肾安胎冲剂与RSA 交集基因KEGG 通路富集分析

6 活性成分与靶点基因的分子对接验证

运用Vina 对核心网络中的6 个关键靶点与相应成分进行分子对接，获得补肾安胎冲剂中活性分子与受体蛋白的结合关系和结合位置，得到相应对接分数，如表2 所示。一般来说，分值越低，则表明配体与靶蛋白受体结合越稳定[11]。可知，木犀草素（Luteolin）、黄芩素（Baicalein）与AKT1 的结合性最好（图7），结合后呈现稳定状态。

图7 木犀草素（上）、黄芩素（下）与AKT1 的分子对接图

表2 关键成分与核心靶点分子对接结果

讨论

依据中医理论，RSA 属中医学“滑胎”“数堕胎”范畴。中医认为，该病主要为母体冲任损伤或胎元不健导致，具体又有肾虚、脾肾亏虚、气血两虚、血热、血瘀、肝郁等诸多病因[12]。近代医家多认为脾肾亏虚是其发病的重要病机，临床多用补肾健脾之法，补肾安胎冲剂亦为该法之重要应用。本研究通过利用现代网络药理及分子对接技术，尝试探讨补肾安胎冲剂从多成分、多靶点、多途径共同作用治疗RSA 的可能作用机制。

图4 PPI 网络的构建

本研究筛选出补肾安胎冲剂核心化合物有白桦脂酸、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素等。这些化合物大部分属于黄酮类化合物，具有抗炎抗菌、抗氧化及调节代谢等作用[13]。槲皮素多存在于桑寄生、菟丝子等中药，研究发现其具有调节妊娠小鼠子宫内环境、改善小鼠胚泡着床障碍等作用[14]。木犀草素能通过抑制TNF-α、IL-1β 等的释放起到抑制炎症损伤的作用，同时可调节滋养细胞的侵袭能力[15]。黄芩素可通过提高滋养细胞的增殖及侵袭力直接影响胚胎黏附和着床过程[16-17]，且能通过影响CD80/CD86 的表达建立以Th2 为主的外周特异性免疫耐受[17]。

通 过 构 建PPI 网 络，发 现AKT1、CCND1、MAPK14、TP53、JUN、ESR1 是补肾安胎冲剂治疗RSA 的核心蛋白。中医认为，妇人妊娠后，胚胎的发育全赖母之血以养胎，其生长发育离不开母血之滋养。AKT1 是PI3K-AKT 信号通路中极为重要的下游靶激酶，可介导新血管的形成，与中医化生气血以养胎的理念相符。CCND1 为细胞周期调节蛋白，研究表明，该蛋白有利于妊娠早期胚胎着床、妊娠建立与维持，而细胞周期调节蛋白表达量下降可能是早期自然流产的发病机理之一[18-19]。MAPK 参与调节基因表达，活化后的MAPK 可快速增加细胞裂解，从而影响血管生成等方面。前期研究[11]表明，补肾安胎冲剂可通过提高RAS 及MAPK 蛋白水平的表达以达到促进母胎界面血管生成的作用。研究[19-20]表明，TP53 在URSA 患者绒毛组织中呈高表达，其可阻断细胞周期、促进细胞凋亡，使滋养细胞凋亡明显，而敲除TP53 可促进滋养细胞的迁移和抑制细胞凋亡。有学者指出，JUN 的表达增加可以增加滋养细胞侵袭，胚泡着床后，其表达较正常内膜增加[21]。同时，ESR1 基因多态性亦可增加RSA 的发病风险[22]。

GO 功能富集及KEGG 分析表明，补肾安胎冲剂可通过参与多种生物学过程及多个信号通路治疗RSA。KEGG 分析得出信号通路主要包括PI3K-AKT信号通路、内分泌抵抗、AGE-RAGE 信号通路、p53信号通路、IL-17 信号通路等，与前期研究结果[23-24]]大致相符。亦有研究[25]表明，调控AGE-RAGE 信号通路也能对子鼠发育及出生异常起到明显的保护作用。p53 是与生育、生殖等多种生物学过程相关的肿瘤抑制因子，其可通过参与多种信号通路介导蜕膜化受损，影响胚胎着床从而导致RSA 的发生[26]。同时，Th17/Treg 及IL-17 高表达导致的免疫平衡失调是URSA 发生的原因之一[27]。

运用分子对接技术，选取预测靶点最多的活性成分木犀草素及黄芩素为配体，选取PPI 网络中degree最大的靶点AKT1 为受体。结果显示木犀草素、黄芩素能够稳定对接到AKT1 的蛋白结构上。结果显示筛选的靶点受体蛋白与活性成分具有较好的结合活性。

本研究在前期研究的基础上，另辟蹊径，在网络药理学及分子对接层面进行研究，进一步探明补肾安胎冲剂治疗RSA 的内在机制。结果表明补肾安胎冲剂主要通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素等多种活性成分作用于AKT1、CCND1、MAPK14、TP53、JUN、ESR1 等基因，通过调控多种生物学功能和多条信号通路，从而起到治疗RSA 的作用，揭示了补肾安胎冲剂具有多成分、多靶点、多途径的作用机制，为深入研究补肾安胎冲剂治疗RSA 的分子机制奠定基础，为其临床应用提供一定的参考价值。