微小RNA663b对口腔鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化的影响

丛碧桥 刘晓萍 陈嘉雯 李洪利 范欣，

1.潍坊医学院附属医院口腔科，潍坊 261000；2.潍坊医学院口腔医学院，潍坊 261053；3.潍坊医学院医学研究实验中心，潍坊261053

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）可发生于舌前2/3、牙龈、硬腭、口底、嘴唇、颊黏膜等[1]。尽管采用多学科联合诊疗可以改善患者的预后[2]，但OSCC 患者的5 年生存率仍不理想，25%～50%OSCC 患者可能会发生局部复发和转移[3]。2020 年有45 万人因头颈部鳞状细胞癌而死亡，OSCC 占其中主要构成[4]。因此，深入研究OSCC 的分子机制，发现新的治疗靶点，可以为该疾病的治疗带来新的思路。

微小RNA（miRNA）是一类短的，不具有编码能力的RNA[5]，可以与靶向基因的3’-非翻译区中的互补位点进行结合，诱导转录本的降解或翻译抑制[6]，在OSCC 的异常表达中起重要作用[7]，其失调可通过调节相关的信号转导途径来影响肿瘤的进展[8]。已有研究发现，多种miRNA在OSCC中发挥作用，miR-663b 在子宫内膜癌[9]、鼻咽癌[10]中发挥作用，但尚未有探讨miR-663b 在OSCC 中的作用。

本研究通过生物信息学方法筛选OSCC相关的预后生物标志物，选择上调的差异表达基因miR-663b 作为研究对象，并预测其靶基因为SH3BP2。探讨miR-663b是否可以通过靶向SH3BP2影响OS‐CC 的迁移、侵袭和上皮间质转化（epithelial mes‐enchymal transition，EMT），为OSCC 的诊疗提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 获取组织标本 收集2021 年1—12 月于潍坊医学院附属医院行手术切除且资料完整的患者24例，每位患者术前未接受放、化疗，切取获得的病理标本诊断均为OSCC。参与研究的患者男性13例，女性11例，年龄5～85岁，中位年龄62岁，获取的新鲜组织标本立即放入−150 ℃冰箱保存。患者或其家属签署知情同意书，本实验已获得医院伦理委员会的批准。

1.1.2 其他材料获取 人正常口腔上皮细胞（HOEC 细胞株）（北京北纳创联生物技术研究院），HEK293T（美国典型培养物保藏中心），OSCC 细胞CAL27、HN30 和SCC-9（上海市口腔颌面部肿瘤组织样本及生物信息数据库专业技术服务平台）。miR-663b 茎环结构（上海生物工程有限公司），兔抗人SH3BP2 单克隆抗体、小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏着蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）抗体（Abcam 公司，英国），pGL3-SH3BP2 3’UTR-WT（野生型）和pGL3-SH3BP2 3’UTR-MUT（突变型）双荧光素酶报告基因载体、miR-663b 敲除质粒（Anti-miR-663b）以及阴性对照质粒Anti-NC（上海吉凯基因医学科技股份有限公司），荧光素酶报告基因载体（普洛麦格公司，美国）。

1.2 在线预测网站

使用基因表达数据库（gene expression omni‐bus，GEO）中OSCC miRNA（GSE28100 和GSE-45238）与mRNA 表达数据集（GSE78060 和GSE-13601），使用R Studio 进行差异表达分析，以P<0.05且|logFC|>1作为筛选阈值。

MiRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和microRNA目标预测数据库（microRNA Target Prediction Database，miRDB）预测与miR-663b存在互补序列的靶基因。人类蛋白质表达图谱（the human protein atlas，HPA）采用高度特异性的抗体，用免疫组化技术进行差异表达分析，为研究提供新的思路和帮助，查找SH3BP2 在OSCC 组织和正常组织中的表达情况。基因表达谱分析（gene expression profilling interactive analysis，GE‐PIA）在线网站下载SH3BP2 头颈部鳞状细胞癌患者生存曲线。

1.3 细胞培养及处理

HN30、CAL27、SCC-9 均使用RPMI 1640 培养基，HOEC、HEK293T 细胞使用DMEM 培养基（含10%胎牛血清），培养箱环境：5%CO2、37 ℃以及97%的湿度，2～3 d及时换液传代。使用Lipo‐fectamine2000 进行转染操作。将转染后细胞进行分组：1）Anti-NC/HN30 组：转入miR-663b 的对照质粒；2）Anti-miR-663b/HN30 组：转入miR-663b 的敲除质粒；3）Anti-NC+Scr/HN30 组：转入miR-663b 的对照质粒和SH3BP2 空载对照质粒；4）Anti-NC+SiSH3BP2/HN30 组：转入miR-663b的对照质粒和SH3BP2 敲低质粒；5）Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30 组：转入miR-663b 的敲除质粒和SH3BP2敲低质粒。

1.4 荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

细胞培育良好后，使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，合成cDNA 并稀释，以cDNA 为模板进行qRT-PCR。miR-663b上游引物序列：5’-GGTGGCCCGGCCGTGC-3’，下游引物序列：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；茎环结构：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTCAG；采用U6 作为内参，采用2−ΔΔCt分析的方法进行分析。每组实验均重复3次。

1.5 Transwell迁移和侵袭实验

迁移实验：取含有4×104个细胞的悬液200 μL，小室不含Matrigel 基质胶，将悬液添加到上室中，下室加入500 μL 胎牛血清。侵袭实验：取含有4×104个细胞的悬液200 μL，小室添加Matrigel 基质胶，将细胞悬液添加到上室中，下室加入500 μL胎牛血清。培养24 h，甲醇固定20 min，PBS清洗干净后染色35 min，清洗晾干后，光学显微镜下随机选取3个良好视野拍照，计数穿过小室细胞的平均值为结果。所有实验均独立重复3次。

1.6 Western blot实验

分别将Anti-NC/HN30组和Anti-miR-663b/HN-30 组提取总蛋白质，检测蛋白质浓度，上样后凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃一抗过夜，洗膜，二抗常温孵育1 h，洗膜，胶片曝光，分析灰度值。抗体配制如下：β-actin（1∶1 000）、SH-3BP2（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cad‐herin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）。每组实验均重复3次。

1.7 双荧光素酶实验

293T接种到24孔板，将miR-663b敲除质粒及其对照分别与SH3BP2 的3’UTR 野生型（pGL3-SH3BP2 3’UTR-WT）和突变型（pGL3-SH3BP2 3’UTR-MUT）共转染入细胞，转染培养48 h，弃上清后PBS 清洗，加PLB 裂解15 min；收集裂解液，并与空载对照比较荧光素酶活性。每组实验均重复3次。

1.8 统计学方法

所有数据采用SPSS 22.0 软件进行分析，符合正态分布的计量资料使用均数±标准差表示。独立样本t检验进行两组间均数比较；单因素方差分析用于多组间比较，所有实验均相同条件重复3 次，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 数据分析，选择研究对象

在GSE28100 和GSE45238 数据集中，以P<0.05，|logFC|>1 作为筛选阈值，结果发现GSE-28100中有113个表达上调的miRNA，36个表达下调的miRNA；GSE45238 中有29 个表达上调的miRNA，51 个表达下调的miRNA，热图显示部分差异表达miRNAs（图1A）。在GSE28100 和GSE-45238 数据集上调的miRNAs 中有17 个交集miR‐NAs（图1B），除miR-663b 及miR-33a 未有研究，其余均已有研究，选择差异表达倍数更高的miR-663b 作为后续研究。通过对GSE28100 和GSE-45238 数据集分析后发现，miR-663b 在OSCC 组织中的表达升高（P<0.05）（图1C）。

图1 GSE28100和GSE45238差异表达分析Fig 1 Differential expression analysis of GSE28100 and GSE45238

2.2 miR-663b 在OSCC 组织和癌旁正常组织中的表达

通过qRT-PCR 检测发现，与癌旁正常组织比较，OSCC 组织中miR-663b 的表达升高（P<0.05）（图2）。

图2 miR-663b在OSCC组织和癌旁正常组织中的表达Fig 2 The expression of miR-663b in OSCC tissues and adja‐cent normal tissues

2.3 敲除miR-663b可以抑制OSCC细胞HN30的迁移和侵袭能力

使用qRT-PCR 检测miR-663b 在HN30、CAL-27、SCC-9 和HOEC 细胞中表达情况。结果显示miR-663b在OSCC 细胞CAL-27、HN30、SCC-9中表达高于人HOEC 细胞，其中HN30表达最高，差异具有统计学意义（P<0.05）（图3A），因此选用HN30 作为后续研究。转染质粒后，qRT-PCR 实验检测HN30 中miR-663b 的表达水平。结果显示，Anti-miR-663b/HN30 组中的miR-663b 表达明显降低，Anti-NC/HN30 组的表达较高，2 组比较差异具有统计学意义（P<0.05）（图3B），表明转染成功。Transwell 迁移实验结果显示Anti-NC/HN30 组中穿过基底膜的细胞数量明显多于Anti-miR-663b/HN30 组，差异有统计学意义（P<0.05）（图3C）。Transwell 侵袭实验检测结果显示Anti-NC/HN30 组中穿过基底膜的细胞数量多于Anti-miR-663b/HN30 组，差异有统计学意义（P<0.05）（图3D）。以上实验结果表明，当miR-663b 的表达降低时，OSCC细胞HN30的迁移和侵袭能力受到抑制。

图3 qRT-PCR检测miR-663b表达和Transwell实验检测转染后HN30细胞的迁移和侵袭能力Fig 3 qRT-PCR detection of miR-663b expression and Transwell experiment to detect the migration and invasion ability of HN30 cells after transfection

2.4 敲除miR-663b 可以抑制OSCC 细胞HN30 的EMT发生

采用Western blot实验检测Anti-NC/HN30组和Anti-miR-663b/HN30 组中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin的蛋白质表达水平。结果显示与Anti-NC/HN30 组相比，Anti-miR-663b/HN30 组中相关标志物E-cadherin 表达上调，而N-cadherin 和Vimentin的表达下调（P<0.05）（图4）。结果表明，敲除miR-663b可抑制OSCC细胞HN30的EMT发生。

图4 转染miR-663b敲除质粒后抑制OSCC细胞HN30的EMT发生Fig 4 Inhibition of EMT of OSCC HN30 after transfection of miR-663b interference plasmid

2.5 miR-663b与SH3BP2靶向结合

利用miRNA 靶基因预测网站（miRWalk 和miRDB）预测与miR-663b存在互补序列的靶基因分别为15 023个和333个。GSE78060和GSE13601两个数据集中以P<0.05，|logFC|>1作为筛选阈值，下调差异表达miRNAs分别为1 710个和741个，在4组数据中取交集，SH3BP2既具有与miR-663b结合靶点又在OSCC中表达下调（图5A）。GEPIA数据库显示相较于低表达SH3BP2 的头颈部鳞状细胞癌患者，高表达SH3BP2 的头颈部鳞状细胞癌患者预后更好（图5B）。观察荧光素酶活性，miR-663b敲除质粒与pGL3-SH3BP2 3’-UTR-WT共转染后活性降低，差异具有统计学意义（P<0.05）（图5C），miR-663b 与SH3BP2 靶向结 合。Western blot 结果显示，SH3BP2在Anti-miR-663b/HN30组中的表达高于在Anti-NC/HN30 组中的表达（P<0.05）（图5D），表明miR-663b可以影响SH3BP2的表达。利用Western blot 实验检测OSCC 组织和癌旁正常组织中的SH3BP2的表达情况，结果显示，SH3BP2在正常组织中表达高于癌症组织（P<0.05）（图5E）。综上所述，miR-663b与SH3BP2存在靶向结合关系。

图5 SH3BP2是miR-663b的靶点Fig 5 SH3BP2 is the target of miR-663b

2.6 敲除miR-663b 可以靶向SH3BP2 抑制OSCC细胞HN30的EMT发生

检测Anti-NC+Scr/HN30、Anti-NC+SiSH3BP2/HN30和Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30组中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 的蛋白质表达水平。结果显示与Anti-NC+Scr/HN30组和Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30 相比，Anti-NC+SiSH3BP2/HN30组中E-cadherin 表达下调，而N-cadherin 和Vimen‐tin的表达上调（图6）。结果表明，miR-663-b可以靶向SH3BP2影响OSCC细胞HN30的EMT发生。

图6 敲除miR-663b可以靶向SH3BP2抑制OSCC细胞HN30的EMT发生Fig 6 knockout of miR-663b can inhibit EMT of HN30 in OSCC by targeting SH3BP2

3 讨论

OSCC是头颈部鳞状细胞癌的主要类型，是一种转移后生存率较低的恶性肿瘤[11]。为寻找新而有效的治疗方法，本文通过差异表达分析等生物信息学方法展开研究，具有样本数据量大、临床和预后信息全面等优点，本文还将生信与基础实验相结合，通过实验验证增加靶点可信度。

miRNA与靶向基因的3’-非翻译区中的互补位点结合，从而发挥作用。Wang 等[10]研究发现，miR-663b 通过直接靶向鼻咽癌中的SMAD 家庭成员7（SMAD family member 7，SMAD7）促进细胞增殖和上皮向间充质转化，Shu 等[12]验证，敲低miR-663b 可以通过调节肿瘤蛋白p73 的表达抑制骨肉瘤的细胞增殖并促进其凋亡。Du 等[13]发现血浆中的miR-497 和miR-663b 水平可能是膀胱癌的新生物标志物。本研究对miR-663b 在OSCC 中发挥的作用进行探讨。通过microRNA 分析网站分析并检测miR-663b 在OSCC 组织中的表达并选为目的基因，通过qRT-PCR实验验证，miR-663b在OSCC 细胞HN30 中表达较高（P<0.05），Transwell 实验证实，转染miR-663b 敲除质粒可抑制OSCC 细胞HN30的迁移及侵袭能力，表明miR-663b在OS‐CC的迁移和侵袭中发挥作用。

EMT 是一种复杂且可逆的生物学过程，可以使上皮细胞变成间充质细胞状态的细胞，在肿瘤进展中的重要性已经被证实[14]。E-cadherin 表达降低的同时，往往伴随N-cadherin表达升高，即“钙黏蛋白转化”，EMT 主要通过影响E-cadherin 介导的细胞间黏附和信号传导的信号通路进行调控，E-cadherin 表达降低可抑制EMT[15-16]。在本研究中通过Western blot 实验证明转染miR-663b 敲除质粒可使E-cadherin 表达上调，而N-cadherin 和Vimen‐tin 的表达下调，表明敲除miR-663b 可抑制OSCC细胞HN30的EMT发生。

SH3BP2 是一种信号转导蛋白，主要在免疫细胞（包括T 细胞、B 细胞、巨噬细胞及破骨细胞）中表达[17]，与多种疾病密切相关，Kawahara 等[18]发现SH3BP2缺乏可改善小鼠系统性红斑狼疮，可为自身免疫性疾病的治疗提供新的方法。SH3BP2与肿瘤的发展也有一定关系，Lin 等[19]证实敲低SH3BP2 可以促进小鼠肿瘤的形成。SH3BP2 与牙周病的发展有一定关系，Kittaka 等[20]发现SH3BP2是一种新型的牙周炎牙槽骨吸收调节剂。本研究发现miR-663b 在OSCC 中发挥原癌基因的作用与SH3BP2 有关。通过基因预测网站及基因芯片筛选出可以靶向miR-663b 并且在OSCC 中表达下调的SH3BP2，生存分析结果显示，高表达SH3BP2 的头颈部鳞状细胞癌患者预后较好，双荧光素酶实验验证miR-663b 与SH3BP2 存在靶向结合关系，Western blot 实验则验证了敲除miR-663b 可以靶向SH3BP2抑制OSCC细胞HN30的EMT发生。

综上所述，miR-663b 在OSCC 组织呈高表达，敲除miR-663b会上调SH3BP2的表达并导致OSCC细胞迁移、侵袭和EMT的降低，在以后的发展中，为抑制OSCC侵袭和转移，提供新的理论支持。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。