激光人工皱缩在单囊胚玻璃化冻融周期中的应用价值▲

张小慧 王世凯 毛献宝 李政达 韦娉嫔 陈良师 薛林涛

(广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心，南宁市 530021)

近年来随着人类辅助生殖技术成功率的提高，多胎妊娠导致的孕产期并发症风险成为新的关注点，单胎足月活产已逐渐成为评价治疗效果的关键指标，而单胚胎移植是获得单胎足月活产的最有效途径。囊胚移植由于具有胚胎发育与子宫内膜同步性更好、囊胚种植潜力更高等优点，是目前单胚胎移植周期中的首选治疗方案[1]。同时，解冻囊胚移植不仅可以降低卵巢过度刺激综合征的发生率，还可以改善子宫内膜薄的患者的临床结局，以及减少新鲜囊胚移植导致的低出生体重和先天畸形的发生[2-5]。因此，解冻单囊胚移植已成为辅助生殖技术治疗的一种重要手段。

减轻玻璃化冻融过程对囊胚发育的潜在损伤，是改善解冻单囊胚移植临床结局的重要途径。扩张的囊胚腔内存在大量液体，玻璃化冻融过程中存在冷冻保护剂不能充分与水分子置换的风险，容易形成冰晶，导致细胞损伤。而在囊胚冷冻前进行激光打孔以释放囊胚腔内液体，可以有效地提高囊胚玻璃化冻融后的复苏效率[6]，但是激光人工皱缩的临床应用价值还有待进一步探讨。因此，本研究基于单囊胚移植周期，分析激光人工皱缩对玻璃化冻融周期临床妊娠结局的影响，探讨其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2013年1月至2019年1月在广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心接受单囊胚玻璃化冻融周期治疗的296例患者(296个周期)的临床资料。根据囊胚玻璃化冷冻前是否进行激光人工皱缩，将患者分为人工皱缩组和非人工皱缩组，分别为158例(158个周期)、138例(138个周期)。所有参与本研究的患者均充分知情同意并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 超促排卵方案与胚胎评估：根据患者基本情况选择超促排卵方案，包括长方案、拮抗剂方案、微刺激方案、自然周期方案、黄体期超促排卵和孕激素期促排卵方案。当有两个卵泡直径≥18 mm时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG；丽珠医药)10 000 IU,34～36 h后在阴道B超引导下穿刺取卵。根据精子情况行常规体外受精或卵胞浆内单精子显微注射授精，观察受精和胚胎培养情况。经患者知情同意后将受精后第3天剩余的胚胎行囊胚培养。受精后第5天及第6天观察胚胎并进行质量评级[7]。囊胚移植或者冷冻保存的标准：囊胚腔分期为3期以上的内细胞团或滋养外胚层细胞评级至少有1个≥C级。在解冻复苏周期，根据患者情况选择自然、人工或促排卵周期方案行子宫内膜准备。

1.2.2 激光人工皱缩：采用OCTAX激光破膜仪(德国MTG公司)对人工皱缩组的扩张囊胚(Gander评分[7]为3期及3期以上为扩张囊胚)进行激光人工皱缩，在远离内细胞团的滋养层稀疏处，使用3.5 ms的单次脉冲激光打孔，囊胚腔液迅速流出，囊胚腔皱缩，至囊胚腔完全收缩后，行囊胚玻璃化冷冻。非人工皱缩组囊胚不进行激光人工皱缩，直接玻璃化冷冻。

1.2.3 囊胚玻璃化冷冻及复苏：使用囊胚冷冻/复苏试剂盒(COOK公司)对囊胚进行玻璃化冷冻和复苏。(1)玻璃化冷冻步骤。将囊胚放入V1液平衡5 min，转移至V2液2 min，最后转移至V3液，30～60 s内将囊胚装载到标记好患者信息的高效安全封闭式载杆(Cryo Bio System公司)，迅速套外管加热封口，放入液氮冷冻保存。(2)复苏步骤。将装载有囊胚的高效安全封闭式载杆迅速从液氮取出，放入W1液，囊胚脱落后转移至新的W1液中平衡5 min，依次将囊胚在W2液和W3液中各平衡5 min。最后将囊胚转移至预先平衡好的G-2TM培养皿(瑞典Vitrolife公司)中，置于37 ℃、6% CO2、5% O2培养箱中培养2～3 h，观察囊胚是否复苏成功。囊胚重新扩张到正常内细胞团和滋养外胚层形态，则视为存活并移植。复苏成活囊胚数/解冻囊胚数为复苏率。

1.2.4 观察指标：复苏囊胚移植14 d后，检测血hCG，阳性为生化妊娠。复苏囊胚移植35 d后B超检查见到宫内孕囊为临床妊娠，胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%(单囊胚移植孕囊数仅计为1)。孕12周内妊娠丢失为早期流产，孕周≥28周分娩存活婴儿为活产。

1.3 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示， 组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组基本情况的比较 两组女方年龄、子宫内膜厚度差异均无统计学意义(均P>0.05)，组间具有可比性；人工皱缩组囊胚复苏率高于非人工皱缩组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组基本情况的比较

2.2 两组妊娠结局的比较 人工皱缩组的临床妊娠率、胚胎种植率和活产率均高于非人工皱缩组(均P<0.05)。两组生化妊娠率、早期流产率和单卵双胎率比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组妊娠结局的比较[%(n/N)]

3 讨 论

随着辅助生殖技术的发展，妊娠率逐渐提高，同时多胎妊娠导致的妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、低出生体重和早产等并发症越来越受到关注[8-9]。预防多胎妊娠的最佳方法是单胚胎移植，而单囊胚移植是较好的选择[10]。囊胚体外培养可以筛选具有更好发育潜能的胚胎，囊胚移植时子宫内膜和胚胎发育的同步性更好，从而提高胚胎种植率，改善新生儿的临床结局[11]。解冻囊胚移植周期的子宫内膜容受性及胚胎与内膜的发育同步性比新鲜囊胚移植周期更好，胚胎种植率和临床妊娠率更高，早产率更低[12]。此外，解冻单囊胚移植周期的临床妊娠率和活产率显著高于单卵裂移植，且与双胚胎移植无显著差异，同时其可以显著降低多胎妊娠率和早产率[13]。因此，解冻单囊胚移植在辅助生殖领域中得到广泛认可。然而，扩张囊胚的腔液可能会影响囊胚的冷冻复苏效果；玻璃化冷冻前进行激光人工皱缩可以释放囊胚腔液，减少冷冻损伤，降低细胞毒性[6]。因此，本研究探讨了激光人工皱缩在单囊胚玻璃化冻融中的临床应用价值。

玻璃化冷冻是一种成功的囊胚保存方法，影响冷冻囊胚保存成功的重要因素之一是胚胎复苏率。扩张囊胚腔中含有大量的液体，影响囊胚冷冻过程中的脱水速度，延长囊胚在玻璃化冷冻液中的暴露时间，从而增加冰晶形成的风险。玻璃化冷冻前对扩张囊胚行激光人工皱缩，释放囊胚腔液，促进冷冻和解冻过程中保护剂的渗透，减少冰晶的形成，可降低冷冻保护剂的细胞毒性作用，减少渗透压和冰晶对细胞的损伤，从而提高囊胚解冻后的扩张率，降低囊胚的凋亡率[14]。有研究显示，与机械人工皱缩的囊胚相比，激光人工皱缩的囊胚复苏后形态学评分更高，且移植后的临床妊娠结局更好[15]。本研究采用激光对单囊胚行人工皱缩，玻璃化冻融后人工皱缩组的囊胚复苏率为99.37%，高于非人工皱缩组的囊胚复苏率(97.87%)。说明在单囊胚玻璃化冷冻前进行激光人工皱缩，减少囊胚腔液，可以减轻冷冻/解冻对囊胚的损伤，有利于囊胚复苏。但两组的囊胚复苏率差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与本研究样本量小有关。

有文献报告，激光人工皱缩能显著提高解冻后的囊胚存活率和临床妊娠率[16]。这是因为，囊胚腔液释放后，不同大小的新鲜囊胚皱缩，呈均一的桑椹胚状，解冻后它们充满液体的速度明显加快，重新扩张的平均时间缩短[17]。而解冻后囊胚再扩张的程度是活产率的最佳预测因子[10]。但是，目前激光人工皱缩对单囊胚解冻移植临床结局的影响如何，相关研究较少。本研究结果显示，人工皱缩组的临床妊娠率、胚胎种植率和活产率均高于非人工皱缩组(均P<0.05)，但两组的生化妊娠率、早期流产率和单卵双胎率差异无统计学意义(均P>0.05)。这说明，在玻璃化冷冻前对单囊胚进行激光人工皱缩以释放囊胚腔液，可以减轻胚胎冻融损伤，提高胚胎发育潜能，从而在不增加多胎妊娠率和早期流产率的基础上，有效地提高单囊胚的种植率和活产率。

综上所述，在囊胚玻璃化冷冻前进行激光人工皱缩，可提高临床妊娠率和活产率，且不增加多胎妊娠率和早期流产率，在单囊胚玻璃化冻融周期中具有临床推广的价值。