血清miR-130a-3p联合胰岛素样生长因子1对2型糖尿病患者并发下肢外周动脉病变的诊断价值▲

刘春阳 王彦辉 方多多 贾 慧 丁 毅 王雷永

(1 北京中医医院顺义医院疮疡血管外科，北京市 101300；2 首都医科大学附属北京中医医院疮疡血管外科，北京市 100010)

我国糖尿病患病率为10.4%，下肢外周动脉病变(peripheral artery disease，PAD)是糖尿病常见的、严重的慢性并发症。动脉粥样硬化是下肢PAD的主要病理改变，易造成下肢血管的狭窄与闭塞；下肢PAD的致死率和致残率均较高，是糖尿病足溃疡及截肢的独立危险因素[1-2]。miRNA是一类非编码RNA分子，参与调节细胞生长发育、增殖等多种生理过程，目前已发现miRNA与多种心血管疾病(如下肢PAD)的发生有关[3]。研究表明，miR-130a-3p在冠心病患者血浆中的表达水平与冠状动脉粥样硬化程度呈负相关，可作为评估冠状动脉粥样硬化的潜在生物标志物[4]。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)不仅具有调节血糖、血脂的作用，还可增加机体对胰岛素的敏感性，刺激血管平滑肌细胞的增殖和迁移，在动脉粥样硬化的形成中发挥重要作用[5]。研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)并发下肢PAD的患者IGF-1表达水平升高，IGF-1高表达是T2DM患者并发下肢PAD的独立危险因素[6]。本研究通过检测T2DM患者血清中miR-130a-3p及IGF-1的表达情况，探讨二者对T2DM并发下肢PAD的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年10月至2020年12月在北京中医医院顺义医院疮疡血管外科就诊的178例T2DM患者作为研究对象，其中男性96例、女性82例，患者年龄50～79(54.00±8.50)岁。根据入院时的踝臂指数[7]判断患者是否并发下肢PAD，然后将患者分为单纯T2DM组90例(踝臂指数>0.90)和并发PAD组88例(踝臂指数≤0.90)。纳入标准：(1)符合《中国2型糖尿病防治指南(2013版)》[8]中T2DM及糖尿病所致下肢PAD的诊断标准；(2)肝肾功能正常，无其他器质性疾病；(3)患者临床资料完整。排除标准：(1)1型糖尿病；(2)合并高血压、心肌梗死、心力衰竭、脑血管疾病、内分泌疾病的患者；(3)近3个月内使用糖皮质激素治疗者；(4)临床资料不全者。本研究通过该院医学伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 TRIzol提取试剂盒购自Invitrogen公司(批号：15596026)；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司(批号：RR036A、RR820A)；miR-130a-3p及U6的引物由上海生工生物公司设计与合成。ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。IGF-1 ELISA试剂盒购自美国Elabscience公司(批号：E-EL-H0086c)。

1.3 研究方法

1.3.1 临床资料的收集：收集所有患者的一般资料及入院时未接受治疗前的血清学指标。一般资料包括性别、年龄、体质指数及病程等。血清学指标包括空腹血糖、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose,2hPBG)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)、三酰甘油、总胆固醇、HDL-C、LDL-C等指标。计算稳态模型胰岛素抵抗(homeostasis model-insulin resistance，HOMA-IR)指数，HOMA-IR指数=空腹血糖×FINS/22.5。

1.3.2 踝臂指数的测量：于患者入院时未接受治疗前进行测量。取仰卧位，采用彩色多普勒血流探测仪(日本林电气株式会社，型号ES-100V3)测量双侧前臂肱动脉收缩压，以最高值为肱动脉压，然后测量与肱动脉收缩压同侧的胫后动脉和足背动脉收缩压，以最高值为踝动脉压。计算踝臂指数，踝臂指数=肱动脉压/踝动脉压。

1.3.3 样品采集及保存：于入院时未治疗前，采集患者清晨空腹肘静脉血5 mL，装入试管，2 000～3 000 r/min离心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测血清miR-130a-3p表达水平：使用TRIzol试剂提取血清中的总RNA，采用NanoDrop 2000c微量分光光度计(Thermo Scientific公司)检测总RNA的浓度及纯度，使用反转录试剂盒合成cDNA，采用实时荧光定量PCR检测各组患者血清miR-130a-3p表达水平。miR-130a-3p基因和U6基因引物序列见表1。PCR反应总体系为20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、灭菌蒸馏水6 μL。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃、45 s，65 ℃、15 s，72 ℃、15 s，40个循环。每个样品设置3个复孔。反应结束后，以U6作为内参，采用2-ΔΔCt分析法计算miR-130a-3p的相对表达水平。

表1 引物序列

1.3.5 ELISA检测血清IGF-1表达水平：采用ELISA试剂盒检测两组患者的血清IGF-1表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson法分析血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平与踝臂指数的相关性；采用Logistic回归分析影响T2DM患者并发下肢PAD的危险因素，采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平对T2DM患者并发下肢PAD的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者临床资料的比较 两组患者的空腹血糖、HbA1c、2hPBG、三酰甘油、FINS、HOMA-IR指数及踝臂指数比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)；两组患者的年龄、性别、体质指数、病程、总胆固醇、HDL-C、LDL-C比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组患者临床资料的比较

2.2 两组患者血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平的比较 并发PAD组患者血清miR-130a-3p表达水平低于单纯T2DM组，IGF-1表达水平高于单纯T2DM组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组患者血清miR-130a-3p相对表达水平和IGF-1表达水平的比较(x±s)

2.3 并发下肢PAD患者血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平与踝臂指数的相关性 并发PAD组患者血清miR-130a-3p表达水平与踝臂指数呈正相关性(r=0.405，P<0.001)，血清IGF-1表达水平与踝臂指数呈负相关性(r=-0.533，P<0.001)。

2.4 血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平对T2DM患者并发下肢PAD的诊断价值 血清miR-130a-3p表达水平诊断T2DM患者并发下肢PAD的曲线下面积为0.857(95%CI：0.797，0.905；P<0.001)，截断值为0.71时敏感度为82.95%，特异度为85.56%。IGF-1表达水平诊断T2DM患者并发下肢PAD的曲线下面积为0.832(95%CI：0.768，0.883；P<0.001)，截断值为162.63 ng/mL时敏感度为84.09%，特异度为75.59%。血清miR-130a-3p与IGF-1表达水平联合诊断T2DM患者并发下肢PAD的曲线下面积为0.923(95%CI：0.873，0.957；P<0.001)，截断值为0.383时敏感度为89.77%，特异度为84.44%，见图1。

图1 血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平对T2DM患者并发下肢PAD的诊断价值

2.5 T2DM患者并发下肢PAD影响因素的Logistic回归分析 以T2DM患者是否并发下肢PAD为因变量(是=1，否=0)，以表2及表3中有统计学意义的指标为自变量(根据ROC曲线的截断值进行赋值：miR-130a-3p表达水平≤0.71=1，miR-130a-3p表达水平>0.71=0；IGF-1表达水平>162.63 ng/mL=1，IGF-1表达水平≤162.63 ng/mL=0，其余变量以实测值纳入)，纳入Logistic回归分析。结果显示，空腹血糖、HbA1c、三酰甘油水平及IGF-1表达水平升高，以及miR-130a-3p表达水平降低是T2DM患者并发下肢PAD的独立危险因素(均P<0.05)，见表4。

表4 T2DM患者并发下肢PAD影响因素的Logistic回归分析

3 讨 论

下肢PAD是糖尿病的主要并发症之一，动脉粥样硬化是其主要病理基础，研究表明胰岛素抵抗、脂质代谢异常、持续高血糖、炎症反应等均是下肢PAD发生的危险因素[9-10]。下肢PAD患者因为下肢缺血，可出现肢体坏疽、截肢等严重不良后果，这严重影响患者的生活质量。因此寻找影响下肢PAD发生的危险因素，对下肢PAD的预防和治疗具有重要意义。

研究表明，miRNA在血管重塑、微血管病变、调节血管内皮细胞功能及糖尿病血管病变中均起到重要作用[11]。miR-130a-3p为miRNA的一种类型，在代谢相关疾病和心血管疾病中发挥重要的调控作用[12]。卢翔等[13]的研究表明，过表达miR-130a可改善T2DM患者外周血内皮祖细胞的黏附和迁移能力，并可抑制白细胞介素18、转化生长因子β1的表达。王晓姣等[14]的研究表明，过表达的miR-130a-3p可能通过抑制蛋白激酶通路来减轻H9c2心肌细胞的肥大程度。另有研究表明，miR-130a-3p在血管生成过程中发挥重要作用，其在神经发育过程中调控感觉和运动神经元中血管内皮生长因子受体2的表达[15]。本研究结果显示，与单纯T2DM组比较，并发PAD组患者血清miR-130a-3p表达水平降低(P<0.05)，提示miR-130a-3p表达水平与下肢PAD的发生有关。

IGF-1是一种胰岛素类似物，具有促生长作用。其主要由肝脏合成和分泌，不仅具有调节血糖、血脂的作用，还可促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，在动脉粥样硬化、血管再狭窄等心血管疾病中发挥重要作用[16-17]。IGF-1可与其受体结合形成复合物沉积在血管壁上，促进血管细胞增殖、分化以使得血管中膜增厚，导致血管管腔狭窄，从而引发微血管病变和大血管病变。Lin等[18]的研究表明，IGF-1可通过激活磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶信号通路，促进内皮细胞/脂肪干细胞共培养体系的血管生成，从而促进新生血管形成。沈宁阳等[19]发现，糖尿病肾病患者血清IGF-1表达水平升高，IGF-1表达水平与糖尿病肾病患者发生肾微血管病变有关，是肾微血管病变的危险因素。还有研究表明，高IGF-1表达水平的肥胖型糖尿病患者的血糖、血脂及左心室射血分数水平均明显低于低IGF-1表达水平者，且高IGF-1表达水平患者胰岛素抵抗程度低，表明血清IGF-1表达水平与糖尿病患者的糖脂代谢和心功能密切相关[20]。本研究结果显示，并发PAD组患者血清IGF-1表达水平高于单纯T2DM组(P<0.05)，这与李倩[6]的研究结果一致，表明IGF-1表达水平升高与下肢PAD有关。

本研究结果显示，并发PAD组患者血清miR-130a-3p表达水平与踝臂指数呈正相关性，血清IGF-1表达水平与踝臂指数呈负相关性(均P<0.05)，进一步证实了血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平与下肢PAD相关。Logistic回归分析结果显示，血清miR-130a-3p表达水平降低、IGF-1表达水平升高是影响T2DM患者并发下肢PAD的独立危险因素(均P<0.05)，提示miR-130a-3p、IGF-1或许可作为诊断T2DM患者并发下肢PAD的标志物。ROC曲线分析显示，血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平单独或联合诊断T2DM患者并发下肢PAD曲线下面积分别为0.857、0.832、0.923，提示血清miR-130a-3p、IGF-1表达水平对T2DM患者并发下肢PAD具有一定的诊断价值，二者联合应用可进一步提高诊断效能。

综上所述，T2DM并发下肢PAD的患者血清中miR-130a-3p呈低表达、IGF-1呈高表达，二者与下肢PAD的发生密切相关，二者联合检测对T2DM患者并发下肢PAD具有一定的诊断价值。