玻璃化法及小液滴玻璃化法对香石竹茎尖超低温保存效果的影响

林 田，杨 华，韩 静，魏仕伟，李天菲

(上海市农业生物基因中心，上海 201106)

香石竹(DianthuscaryophyfllusL.)为石竹科石竹属常绿亚灌木宿根花卉，是世界著名的四大切花之一，其栽培种及野生种资源的有效保存对香石竹的国产化至关重要。香石竹种质资源通常通过品种圃扦插及组织培养定期继代保存，但香石竹一旦被病毒侵染，长期的无性繁殖易导致病毒在植物体内不断积累，难以有效长期保存种质，需寻找更安全长效的保存方法。

超低温保存是指液氮(-196 ℃)下的低温保存。在此条件下，植物生命活动近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，具有资源保存的长期性和稳定性优点。此外，病毒在超低温保存处理过程中会失活，因此可通过超低温手段进行脱毒，这是营养繁殖植物种质资源长期保存的最优选择[1]。超低温保存有多种方法，近年经常运用的以PVS2[2]作为冷冻保存液的玻璃化法，是将植物材料经高浓度的保护液处理后，迅速投入液氮中，使其组织中的水分转变为玻璃化状态，从而避免形成冰晶造成机械损伤，达到有效保护植物的目的。玻璃化法已被运用于100多种植物不同组织的超低温保存中。在常规玻璃化法上发展出来的小液滴玻璃化法，是将植物材料经玻璃化处理后，在铝箔上滴成小液滴，然后直接投入液氮进行迅速冷冻。由于其冻存及解冻速度快，组织不易形成冰晶，并且易成活再生，因此是一种有发展前景的超低温保存方法[3]。

国外关于香石竹的超低温研究始于20世纪70年代，其成活率仅为2%[4]。Uemura等[5]将4～8 ℃驯化处理的香石竹茎尖通过慢冻法进行超低温保存，成活率提高到 70%～80%。后通过两步冷冻法及程序降温法可使香石竹的成活率达90%[6-7]。随着玻璃化试剂的发明，Langis等[8]于 1990年采用玻璃化法成功保存了香石竹茎尖。此后，在常规玻璃化方法上又发展出包埋玻璃化法及小液滴玻璃化法。Halmagyi等[9]将香石竹3个品种的茎尖用海藻酸钠包埋玻璃化处理后进行冻存，成活率为60%～73%。笔者分别采用常规玻璃化法和小液滴玻璃化法对香石竹茎尖的超低温保存技术进行探索，比较2种方法对超低温保存效果的影响，为搭建球宿根花卉的超低温保存技术平台提供技术依据。

1 材料与方法

1.1茎尖准备供试材料主要为香石竹茎尖生长点。茎段诱导无菌苗在含6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+60 g/L蔗糖的MS培养基上，在温度为(25±2) ℃ 、光照强度2 000 lx、光暗周期16 h/8 h条件下培养，继代30 d。解剖镜下剥离切取2～3 mm、带2片护叶的茎尖生长点(图1)。

图1 香石竹组培苗(右下角为剥取的茎尖)Fig.1 Plantlets of D.caryophyfllus (the lower right corner is the peeled shoot tips)

1.2常规玻璃化法冻存

1.2.1预培养。将茎尖接种到含0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖的MS培养基中，在10 ℃下培养1、3、5、7 d。

1.2.2装载及玻璃化。将预培养后的材料在预处理溶液[10](含2 mol/L甘油及0.4 mol/L蔗糖的MS液体培养基)中室温下处理30 min后，转入玻璃化保护剂PVS2进行80 min的冰水浴处理。为得出最佳玻璃化时间，将在0.3 mol/L蔗糖浓度的MS培养基预培养5 d的茎尖分别进行15、30、60、80、120 min的玻璃化处理。

1.2.3冻存及解冻。将茎尖转移至装有预冷新鲜PVS2的2 mL冷冻管中(10茎尖/管)，迅速投入液氮中保存。取出在液氮中冻存1 h以上的冷冻管，立即放入40 ℃水浴中快速解冻2 min。茎尖在室温下用含1.2 mol/L蔗糖的MS培养液洗涤2～3次，每次5～10 min。

1.2.4恢复培养。将洗涤后的茎尖在滤纸上吸干后，转移至含6-BA 0.5 mol/L，NAA 0.1 mol/L和GA30.5 mol/L的MS半固体培养基中暗培养，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中常光培养，培养条件同茎段诱导。定期观察，记录开始恢复生长的天数，20 d后计算成活率及再生率。已恢复生长(萌发根、芽或愈伤组织)的茎尖视为成活；茎尖直接分化而不形成愈伤为再生。试验中每个处理20个茎尖，3次重复。

1.3小液滴玻璃化法冻存将“1.1”所得茎尖按“1.2”的优化方案进行玻璃化处理。仅在冻存前5 min将含有1个茎尖的液滴(约5 μL)滴在5 mm×20 mm的无菌铝箔条上(图2)，再直接投入装满液氮的安培管中。解冻时直接将含液滴的铝箔条投入洗涤液中解冻5～10 min，恢复培养同“1.2.4”。对照为常规玻璃化程序冻存后恢复培养的茎尖。

图2 小液滴玻璃化法处理的香石竹茎尖Fig.2 Shoot-tips of D. caryophyfllus after droplet-vitrification treatment

1.4数据统计与分析试验中每个处理20个茎尖，3次重复。成活率=成活茎尖数/处理茎尖数×100%；再生率=再生植株数/成活茎尖数×100%。试验结果用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1预培养条件对成活率的影响由表1可知，在所设的4个蔗糖梯度下，冻存茎尖成活率随预培养时间增加而上升，到5 d时达最高，预培养时间大于7 d时，成活率下降。预培养时间为1 d时，成活率随蔗糖浓度增加而减少，茎尖切面渗出较多，其中0.7 mol/L的培养基中茎尖明显变软呈水渍状，成活率仅为33.3%。较低蔗糖浓度下预培养3 d以上，茎尖伤口愈合，成活率随蔗糖浓度增加而增加，但蔗糖浓度高于0.7 mol/L，预培养时茎尖易褐变及水渍化，成活率显著下降(P<0.05)。在含0.5 mol/L蔗糖培养基上预培养5 d，可达最高成活率88.3%。

表1蔗糖预培养浓度及预培养天数对成活率的影响

Table1Effectofsugarconcentrationsinthepre-culturemediumandpre-culturetimeonsurvivalrate

%

2.2玻璃化时间对成活率的影响在对茎尖进行玻璃化处理时，处理时间小于15 min，由于保护剂处理时间过短，材料成活率仅为13.3%，随玻璃化时间延长，成活率也上升，到80 min时可达86.7%，但随时间延长成活率略有下降。120 min时，成活率仍可达72.5%(图3)。冻后恢复培养茎尖在3～5 d内萌动，在5～15 d内直接长出新芽，个别茎尖形成愈伤组织。

图3 PVS2处理时间对成活率的影响Fig.3 Effect of PVS2 treatment time on survival rate

2.3小液滴玻璃化法茎尖冻存效果与常规玻璃化方法冻存香石竹茎尖相比，小液滴玻璃化法在优化玻璃化程序下进行冻存，成活率可达95.0%，显著高于常规玻璃化法的成活率86.7%(P<0.05)。小液滴玻璃化法冻存恢复培养时，最快1 d即可见茎尖萌动，再生时间较常规玻璃化法要短3～5 d，成活植株全部再生，长势较常规玻璃化法冻存再生植株强(表2，图4)。

3 讨论

3.1预培养对冻后成活率的影响茎尖的生理状态对冻后成活率有着显著影响。通过低温驯化及短期高浓度蔗糖预培养，可使组织较缓和地脱去部分水分，同时促使细胞分泌保护物质，有利于冻后存活。香石竹植株4～8 ℃冷驯化后冻存，成活率可达70%～80%[11]。在薄荷[12]及苹果[13]茎尖冻存中蔗糖预处理可显著提高成活率。但渗透压过大，易对植物组织造成伤害，需找到合适的浓度。在该试验中以0.5 mol/L的蔗糖浓度培养基预培养成活率最高，而蔗糖浓度为0.7 mol/L时因高渗透压对组织造成伤害，茎尖在预培养时易褐变及水渍化，成活率显著下降。

表2冻存方式对成活率及植株再生的影响

Table2Effectofcryopreservationmethodonsurvivalrateandregenerationrate

图4 常规玻璃化法(左)及小液滴玻璃化法(右)冻存恢复培养7 d后茎尖Fig.4 Shoot-tips cryopreserved by vitrification(left)and droplet-vitrification(right)recovered 7 d

此外，Bouman等[14]指出预培养一段时间除了提高抗冻性外，还促进切取过程中的伤口修复，提高成活。但如预培养时间过长，则不利于茎尖成活，如在石蒜[15]及百合[16]的超低温保存中预培养时间超过7 d，茎尖褐变及生长点顶端闭合，成活率下降。在该试验中，预培养1 d时成活率随蔗糖浓度上升而下降，蔗糖浓度为0.7 mol/L时显著下降，这可能与茎尖伤口在高浓度蔗糖下渗出较多、受伤害较大有关。而预培养3 d时，伤口修复，成活率上升；预培养5 d成活率最高；预培养大于7 d则因护叶闭合、褐变而引起成活率下降。

3.2玻璃化时间对成活率的影响玻璃化试剂可使组织脱去水分，这样在冻存中可进入玻璃化状态而不形成伤害性冰晶，有效地保护细胞。但由于试剂的高渗压伤害及保护剂中DMSO使植物遗传物质改变的潜在性，需严格把握玻璃化处理过程，使植物在达到一定成活率的同时，尽量减少暴露在玻璃化试剂中的时间[17]。在超低温冻存中，不同植物所需玻璃化时间不同，菊花超低温冻存中，玻璃化处理15 min可达到最高成活率[18]。而该试验中玻璃化处理时间少于15 min，由于保护剂处理时间过短，材料脱水不够，成活率仅为13.3%，随时间延长成活率上升，到80 min时成活率最高，若延长至120 min时，仍可达较理想的效果，可见香石竹在较大时间范围内进行玻璃化处理，成活率变动不大，这样就使操作时间相对宽裕。

不同冻存方法所需玻璃化时间也不同，如在香石竹包埋玻璃化冷冻中，品种“Wanessa”在PVS2中处理200 min，可达到最高成活率[8]。相较而言，该试验采用未经包埋的茎尖进行玻璃化冻存达到最高成活率只需80 min，这可能是因为海藻酸钠包埋层在茎尖与玻璃化试剂中起缓冲作用，从而需更长的时间达到完全玻璃化。小液滴玻璃化法因冻存体积小，冻存解冻中容易玻璃化，故在保证一定成活率条件下，采用时间更少，从而减少处理过程中变异及受伤害的可能。

3.3冻存方式对成活率及植株再生的影响冷冻的方法因材料及超低温冰冻方法不同可分为慢速冷冻及快速冷冻法。现在被广泛使用的玻璃化法为快速冷冻，通常采用直接投入液氮以达到快速降温，以躲过最易结冰的温度区间-140～-10 ℃，使细胞内的水分还没来得及形成冰晶，就到达了-196 ℃的安全区。解冻时在40 ℃左右的水浴中快速化冻，避免解冻过程中重结晶现象对细胞造成伤害。根据这个速冻速溶的原理发展出的小液滴玻璃化法，由于冻存体积小，冷冻及解冻速度远高于常规玻璃化法，冰晶不易形成，恢复生长快，成活率高，目前已经成功应用于很多植物组织的超低温保存[2]。较常规玻璃化法，小液滴玻璃化法可使香蕉的成活率提高40%～50%[19]。Halmagyi等[20]用程序降温法、包埋脱水法、直接投入液氮的小液滴玻璃化法和玻璃化法等多种方法对菊花进行了超低温保存，结果表明小液滴玻璃化法保存后得到了较高的成活率，这为植物的超低温保存开辟了新途径。香石竹的超低温保存曾采用慢冻法、二步冷冻法、玻璃化法及包埋玻璃化法取得成功，笔者通过小液滴玻璃化法对香石竹茎尖进行成功保存，证明其是一种有潜力的超低温保存方法，为搭建球宿根花卉的超低温保存技术平台提供了相关技术依据。

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