肿瘤干细胞的放射抗拒相关机制研究进展▲

陈凯华 陈 莉 朱小东

(广西医科大学附属肿瘤医院放疗科，南宁市 530021)

【提要】 放射抗拒是导致肿瘤放射治疗预后不良的原因之一，而放射抗拒可能与肿瘤干细胞(CSC)的存在有关。CSC是一组极少数的增殖特性失控、能够自我更新、多向分化、具有干细胞特性的肿瘤细胞，它们对放射治疗和其他肿瘤治疗存在抗拒性。CSC逃避辐射杀伤的机制主要包括DNA损伤修复、活性氧清除、抗凋亡途径激活、肿瘤微环境调节及细胞处于静止期等几个方面。本文就CSC导致恶性肿瘤放射抗拒的潜在机制进行综述，为探讨靶向杀伤CSC的放射增敏疗法提供一些思路。

随着调强放射治疗、立体定向放射治疗等精确放射治疗技术的普及，放射治疗成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。虽然放射治疗在肿瘤治疗中的疗效和地位突出，但是仍存在对放射治疗不敏感或表现出放射抗拒的情况，而放射抗拒是导致肿瘤放射治疗预后较差的原因之一[1-2]。近年来有学者认为，肿瘤放射抗拒、复发及转移可能与肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)有关[3-4]。CSC是一组极少数的增殖特性失控、能够自我更新、多向分化及具有干细胞特性的肿瘤细胞[5-6]，它们可在放射治疗和其他肿瘤治疗手段下存活[7-8]。本文就CSC导致恶性肿瘤放射抗拒的潜在机制进行综述，为寻找靶向杀伤CSC的肿瘤放射增敏疗法提供一些思路。

1 CSC的定义

美国癌症研究协会(American Association for Cancer Research，AACR)将CSC定义为肿瘤内的一组细胞亚群，其具有自我更新能力并且能够产生异质性肿瘤细胞[6]。CSC具有与正常干细胞相似的特征，可以产生特定肿瘤中所有类型细胞[9]。早在1937年，Furth研究团队[10]将单个小鼠白血病细胞种植到同系正常小鼠内，发现仅有5%的细胞种植成功，提示肿瘤组织中存在CSC。直到1997年，Bonnet等[11]首次在急性髓性白血病中发现CSC。迄今为止，除了在血液肿瘤动物模型中可以鉴定出CSC，在多种人类实体肿瘤中也可以分离鉴定出CSC[12-13]。

2 CSC放射抗拒的机制

鉴于CSC具有细胞无限分裂的潜能[6]，意味着肿瘤在过程中需要灭活CSC才能永久根除肿瘤。越来越多证据表明，CSC与肿瘤出现放射抗拒有关[14-16]。Krause等[14]认为，CSC通过多种机制介导肿瘤产生放射抗拒。由于CSC具有放射抗拒性，目前的放射治疗不能彻底杀灭肿瘤细胞，最终导致肿瘤复发和转移。因此，探索CSC潜在的放射抗拒相关机制，可为靶向杀灭CSC、减少放射抗拒、提高肿瘤的放射治疗疗效提供参考。目前，相关研究主要从DNA损伤修复、活性氧清除、抗凋亡途径的激活、肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)调节及细胞静止期等方面阐述CSC放射抗拒的发生机制。

2.1 DNA损伤修复 DNA损伤修复是生物细胞内的DNA分子受到损伤后，在多种酶的作用下恢复结构的过程。肿瘤的发生与DNA损伤和修复密切相关，人类的大多数致癌过程是由受损DNA的低效修复介导的[17]。在放射治疗过程中，射线通过攻击细胞核中的DNA使其碱基损伤、单链或双链断裂，从而对肿瘤细胞产生直接的杀伤作用，DNA双链断裂被广泛认为是肿瘤细胞被靶向杀伤的主要原因[18]。既往研究证实，实体肿瘤中的CSC亚群具有较高的DNA修复能力[19-22]。Desai等[19]研究发现，从肺癌细胞株A593中分离出的CD133+细胞显示出放射抗拒性，其DNA双链断裂修复能力强，且DNA修复基因表达上调；而沉默DNA修复基因Exo1和Rad51可使CD133+细胞的放射敏感性增强，说明抑制DNA修复可使放射敏感性增强。乳腺癌相关研究表明，上皮-间质转化诱导转录因子ZEB1可以诱导Chk1基因去泛素化，从而促进同源重组依赖性DNA修复和肿瘤细胞放射抗拒的产生，且干扰乳腺癌细胞株SUM159中ZEB1和Chk1的表达均能增强其放射敏感性，因此，上皮-间质转化与乳腺癌CSC的特征密切相关[20]。Wang等[21]研究发现，鼻咽癌干细胞样亚群PKH26+细胞具有放射抗拒性，该细胞亚群的原癌基因c-MYC过表达可导致Chk1和Chk2的表达增加，随后激活DNA损伤-检查点反应机制从而引起放射抗拒性；干扰Chk1和Chk2表达可在体外和体内增加PKH26+细胞的放射敏感性。Bao等[22]研究发现，从原发性胶质母细胞瘤样本中分离出的CSC可优先激活DNA损伤检查点以抵抗辐射，从而更有效地修复辐射诱导的DNA损伤；使用Chk1和Chk2检查点激酶的特异性抑制剂可逆转胶质母细胞瘤CSC的放射抗拒性。因此，DNA 损伤相关修复机制可能是CSC修复辐射损伤的重要机制，一些关键的信号节点(如Chk1和Chk2等)或可作为增加肿瘤放射治疗敏感性的靶点。

2.2 活性氧清除 活性氧是细胞代谢过程中形成的一类单电子还原产物,具有寿命短且极不稳定等特点，主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和一氧化氮等。细胞接受射线照射时，辐射能量可直接损伤DNA，自由基(如活性氧等)也可间接损伤DNA从而导致细胞死亡[23]。细胞内活性氧是导致肿瘤细胞辐射后凋亡的关键因素，而低水平活性氧是肿瘤细胞产生放射抗拒的主要原因之一[24]。有学者发现，通常正常干细胞和CSC的活性氧水平均较低[25-26]。因此，清除或降低活性氧水平也被认为是CSC减少凋亡以逃避辐射杀伤的一种机制[27-30]。Kim等[27]的研究表明，利用无血清培养基培养获得的前列腺癌细胞球(CSC)比贴壁细胞(普通肿瘤细胞)含有更多的低至中等活性氧水平的细胞。该研究还证实前列腺癌CSC的放射抗拒机制除与DNA损伤修复能力强有关外，还与活性氧呈低水平的细胞对辐射损伤的低易感性有关。在部分人和小鼠乳腺癌中，CSC的活性氧水平比对应的非致癌性肿瘤细胞更低，下调细胞内的抗氧化剂谷胱甘肽后，可增加CSC的放射敏感性[28]。Lagadec等[29]也发现，乳腺癌CSC可通过表达高水平的自由基清除因子(如Foxo转录因子家族、谷胱甘肽系统的关键酶及过氧化氢酶等)来逃避辐射。Li等[30]研究发现，经抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸处理过的头颈癌细胞表现出放射抗拒，且CD44+亚群细胞比例增加，表明较低的活性氧水平可以增强放射抗拒性及干细胞特性。综上所述，由于活性氧在辐射诱导的细胞死亡中具有重要作用，因此有理由认为上调CSC中的活性氧水平可改善CSC的放射敏感性，从而提高肿瘤放射治疗的疗效，这也为通过提高活性氧水平或使用活性氧清除剂来降低肿瘤放射抗拒提供理论依据。

2.3 抗凋亡途径的激活 目前，抗凋亡途径的激活也被认为是CSC产生放射抗拒的机制之一[31-35]。Kyjacova等[31]通过分割照射的方法获得一群具有干细胞样特性的非黏附抗失巢凋亡前列腺癌细胞，该细胞亚群的Notch信号通路被激活并表现出放射抗拒性，而联合抑制Erk1/2和PI3K-AKT信号通路可下调抗凋亡因子Bcl-XL，从而增强该细胞亚群的放射敏感性。Chang等[32]使用组织学特征与人基底细胞样乳腺癌相似的抗凋亡基因p53无效的肿瘤模型，然后通过辐射照射，证实了CSC更加具有细胞凋亡抗性，并且表现出更高的DNA损伤修复活性，这些特点可能有助于它们抵抗辐射杀伤。Yang等[33]通过质粒将EB病毒编码的潜伏膜蛋白1导入鼻咽癌细胞中，发现潜伏膜蛋白1可以增加CD44的表达，分选得到的CD44+细胞亚群具有显著的CSC特征及放射抗拒性；探索其原因发现，CD44+细胞亚群中p53磷酸化失活伴随着p53基因下调，表明在CD44+细胞中p53介导的凋亡途径失活与放射抗拒性有关。同样，卵巢癌相关研究显示，转录抑制因子Snail和Slug通过拮抗p53介导的细胞凋亡途径，可使卵巢癌细胞获得与CSC相关的表型特征，从而产生放射抗拒[34]。Wang等[35]利用γ-分泌酶抑制剂抑制了胶质瘤CSC的Notch信号通路，使PI3K/AKT信号失活及髓样细胞白血病1基因表达增多，进而促进了辐射诱导的细胞凋亡，从而使胶质瘤CSC的放射敏感性增强。因此，抗凋亡特性可能是CSC产生放射抗拒的原因之一，激活相关凋亡途径可能是提高CSC放射敏感性的可选手段。

2.4 TME调节 自1889年英国医生Stephen Paget提出肿瘤转移的“种子与土壤”假说以来,越来越多证据表明肿瘤的发展需要肿瘤细胞与微环境的协调。TME即肿瘤细胞的内外环境，包括肿瘤细胞本身、骨髓源性炎性细胞、淋巴细胞、血管、成纤维细胞及细胞外基质等组分[36-37]。TME除了为肿瘤发展提供结构支持，也调节CSC亚群的自我更新、致瘤性(成瘤能力)和转移潜能[38]。目前，有学者认为CSC的放射抗拒除了与内在机制有关外，可能也与外在的TME有关[39-43]。Wozny等[39]认为，CSC处在缺氧微环境中是头颈部鳞癌产生放射抗拒的原因之一。在缺氧条件下，头颈部鳞癌CSC更早表达缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIF)-1α，抑制HIF-1α表达可增加CSC的放射敏感性。Sun等[40]分选出肺癌细胞A549中CD133+的CSC样细胞，发现CD133+的CSC样细胞的HIF-2α水平显著高于CD133-的CSC样细胞，且具有明显放射抗拒性，提示HIF-2α在CD133+的CSC样细胞中高表达可能导致放射抗拒。CSC位于特定的血管龛内并诱导、重塑和参与TME的形成，以促进CSC自身生存、维持干细胞特性，并抵抗放化疗及生物疗法[41]。前列腺癌相关研究表明，主要针对TME中细胞膜结合受体(如内皮细胞和周细胞)的分子靶向药——舒尼替尼可以改善细胞缺氧并抑制血管生成，减少了乙醛脱氢酶阳性的CSC样细胞的数量，并增强这些细胞的放射敏感性[42]。Hambardzumyan等[43]研究发现，接受辐射照射后的髓母细胞瘤的分裂细胞发生了p53依赖性凋亡，但血管周围壁龛中巢蛋白阳性的CSC在辐射后6 h内细胞周期暂停，而在辐射后72 h细胞周期重新启动，提示这些CSC可能是肿瘤复发的责任细胞。由此可知，研发针对TME的抗肿瘤手段，如靶向血管龛治疗或提高TME含氧量以破坏CSC的“宜居”环境，或可消灭CSC，从而提高肿瘤的放射治疗敏感性。

2.5 细胞处于静止期 细胞周期是指细胞从一次分裂完成到下一次分裂结束所经历的全过程。细胞周期的调节可通过阻滞G1期实现，细胞处于阻滞状态即为静止期(G0期)。电离辐射能更有效地清除快速分裂、增殖的肿瘤细胞，但静止期细胞对电离辐射不敏感，其能保持自身完好性，导致肿瘤的再生[44]。由于大多数的CSC都处于细胞周期的静止期，这可能是其对辐射并不敏感的另一原因[45-46]。Pawlik等[47]认为，CSC处于静止期和CSC可塑性是癌症治疗的主要挑战。细胞在G2/M期对射线的敏感性最强，在G1期较不敏感，在S期后期最不敏感[48]。在临床实践中，剂量分割可以将放射抗拒的S期肿瘤细胞重新调整至对放射更敏感的阶段(如G2/M期)[2]。但另一方面，肿瘤细胞暴露于电离辐射等可引起DNA损伤的环境中，G2/M期可出现明显停滞[49]。在肿瘤放射治疗过程中，CSC可发生加速再群体化[46]。Pajonk等[50]认为，CSC通过再群体化和细胞周期再分布机制获得放射抗拒特性。田允鸿等[51]研究发现，乳腺癌CSC的放射抗拒可能与G2期阻滞有关。因此，寻找激发CSC重新进入正常的细胞周期的方法，也将是消除CSC放射抗拒性的手段之一。

3 小结及展望

CSC的放射抗拒特性是导致肿瘤治疗失败的重要原因之一，灭活CSC有望解决临床上肿瘤复发及转移等瓶颈问题。放射治疗作为治疗恶性肿瘤的重要手段，如何提高其对CSC的杀伤作用以改善肿瘤治疗效果显得尤为重要。目前研究认为，CSC逃避辐射杀伤的机制主要包括DNA损伤修复、活性氧清除、抗凋亡途径的激活、TME调节、细胞处于静止期等几个方面。因此，可以考虑从以下几个方面针对如何靶向杀伤CSC进行更深入研究：一是靶向作用CSC的DNA修复关键信号节点或激活相关凋亡途径；二是提高肿瘤细胞中的活性氧水平，人为创造不利于CSC生存的足氧TME；三是激发CSC重新进入正常的细胞周期。综上，CSC导致肿瘤细胞产生放射抵抗的机制错综复杂，未来仍需更多研究进一步证实。随着相关研究的不断深入，将会为提高肿瘤细胞的放射敏感性、控制肿瘤复发及转移找出突破点。