蛛网膜下腔出血早期脑损伤与铁死亡相关性的研究进展

谢冠锋,梁余槟综述, 唐艳艳,秦 超审校

0 引 言

自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)主要由颅内动脉瘤破裂引起，是具有高发病率和高死亡率的脑卒中亚型，并且好发于相对年轻的患者中[1-4]。在过去的临床研究中，脑血管痉挛和迟发性脑缺血被认为是SAH预后不良的影响因素。SAH早期脑损伤最早由Kusaka学者于2004年提出，指SAH发生后72 h内发生的脑水肿、血脑屏障损伤、神经系统炎症及氧化应激等一系列原发性损伤及其直接后果[5]，是有别于脑血管痉挛和迟发性脑缺血导致SAH不良预后的影响因素[6-8]。

铁死亡是一种表现为非凋亡性的新型细胞损伤方式，Dixon等[9]在2012年将该类细胞死亡形式定义为铁死亡。细胞的凋亡和经典类型的坏死损伤常表现为线粒体肿胀和细胞核裂解，铁死亡不同于凋亡和坏死的表现，其特征是线粒体内膜浓缩及外膜破裂、嵴减少或消失[9]。在机制上，铁死亡是一种由铁过载诱发的细胞内多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)过氧化、活性氧蓄积所引起的损伤。

近期研究发现SAH早期脑损伤中神经细胞铁代谢紊乱[10]、线粒体衰竭[11]、活性氧蓄积[12]等多个重要环节与铁死亡的氨基酸代谢、脂质代谢和铁离子代谢三条基本通路(如图1所示)联系密切，研究SAH早期脑损伤中铁死亡的发生和进展的相关机制有望为SAH提供新疗法。

图 1 铁死亡机制图

1 氨基酸通路与蛛网膜下腔出血早期脑损伤

1.1 氨基酸代谢与铁死亡谷氨酸-胱氨酸反向转运体(system Xc)是细胞膜上的交换通道，由溶质载体家族3成员2和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)组成，能以1∶1的比例将胞外的胱氨酸与胞内的谷氨酸进行交换[13]。进入胞内的胱氨酸降解为半胱氨酸之后与甘氨酸结合成谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽是谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)的底物，GPx4在氧化谷胱甘肽的同时将具有潜在毒性的脂质氢过氧化物还原为无毒的脂质物[14-15](如图1所示)。氨基酸的正常代谢是防止不饱和脂肪酸过氧化发生和活性氧蓄积的关键，Xc系统的失活、还原型谷胱甘肽的耗竭以及GPx4的失活会造成脂质过氧化物蓄积，触发铁死亡。

1.2氨基酸通路与蛛网膜下腔出血早期脑损伤SAH早期脑损伤与氨基酸通路的联系最早由Sheng等学者报道，其团队探讨了SD大鼠在发生SAH3、6、9、12、24、72 h后各时间点GPx4的表达水平，发现GPx4在24 h后的表达量急剧下降，同时伴随着脂质过氧化物的蓄积[16]。此外，使用腺病毒在体内和体外对GPx4进行过表达均实现了对SAH早期损伤的保护作用[16]。

在SAH的早期脑损伤中，破入蛛网膜腔隙的血液形成血肿，神经细胞因应激释放促炎因子损伤相关分子模式分子，诱发炎症风暴[17]，此种炎症损伤作用可被Ferrostatin-1(Fer-1)所消除。Fer-1是通过高通量测序筛选的铁死亡特异性抑制剂，能通过激活氨基酸通路的关键分子SLC7A11和GPx4从而减少脂质过氧化物蓄积，抵抗铁死亡[18]。经过Fer-1预处理的SAH大鼠，其促炎因子损伤相关分子模式分子的代表分子高迁移率族蛋白1及下游炎症分子IL-1、IL-6和TNF-α在SAH发生24 h后比模型组显著下降，提示SAH早期损伤中的炎症反应与铁死亡联系密切[19]。此外，诱导大鼠发生SAH 24 h后，Fer-1在提高SLC7A11及GPx4蛋白表达量的同时提高SAH大鼠神经功能评分、改善血脑屏障功能及减轻脑水肿程度[19]。在肿瘤的增殖分化特性研究中发现，肿瘤抑制因子P53能抑制SLC7A11的表达，从而诱导肿瘤细胞发生铁死亡，抑制肿瘤生长[20]。在SAH模型中应用P53抑制剂pft-α可观察到与Fer-1同样的保护效应，即增加SLC7A11和GPx4的表达和减少脂质过氧化物的蓄积[19]，提示肿瘤抑制因子P53是SAH早期损伤加重的重要调控因子。

2 脂肪酸通路与蛛网膜下腔出血早期脑损伤

2.1脂肪酸代谢与铁死亡多聚不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty Acids, PUFAs)是具有多个双键的脂肪酸，含有磷脂的氧化多聚不饱和脂肪酸是导致铁死亡发生的主要杀手；而酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long-chain family member，ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3是将PUFAs磷脂化的关键因子[21](如图1所示)。虽然ACSL家族的其他成员也能对脂肪酸进行酯化，但ACSL4可通过改变细胞膜的脂质组成增加细胞对铁死亡的敏感性[22]，其对铁死亡的调控具有特异性。PUFAs被氧化之后生成的过氧化产物，如4-羟基壬烯醛、丙二醛等，在胞内蓄积最终导致铁死亡。ACSL4和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3的激活可导致PUFAs过氧化增强，当其超过GPx4的还原极限即触发铁死亡。

2.2脂肪酸通路与蛛网膜下腔出血早期脑损伤Li等[23]运用透射电镜在SAH大鼠脑切片中观察到铁死亡特征性的线粒体皱缩，并在体外模型中验证了脂质过氧化物的沉积，而Fer-1干预组在体内外分别表现为大鼠神经元线粒体损伤减轻和脂质过氧化物的蓄积减少。该实验提示SAH早期损伤中脂质过氧化物的蓄积与铁死亡相关。

Liproxstatin-1(Lip-1)是铁死亡脂质过氧化物的特异性抑制剂[18]，侧脑室注射Lip-1(10 mg/kg)能改善小鼠SAH早期损伤中的神经功能损伤、脑水肿、线粒体功能紊乱、血脑屏障损伤和体重下降[24]。此种保护效应通过抑制ACSL4表达和减少PUFAs的代表物质花生四烯酸实现。此外，Lip-1抑制SAH发生后小胶质细胞活化，减轻早期损伤中的炎症反应，同样证实了SAH早期损伤中的炎症反应与铁死亡相关[24]。类似地，Qu等[25]采用干扰小RNA的方法在SAH大鼠模型中对ACSL4进行敲除，其结果与Lip-1抑制效应一致，减轻了大鼠SAH早期损伤，并且炎症因子的表达也同样被抑制。

3 铁代谢通路与蛛网膜下腔出血早期脑损伤

3.1 铁代谢与铁死亡铁过载是铁死亡触发的关键因素。铁离子有Fe2+和Fe3+两种形态，其中Fe3+为稳定铁离子，是铁离子在人体中的储存形式；Fe2+为不稳定铁离子，是铁离子结合酶执行功能的形式[26]。神经元细胞膜上存在转铁蛋白受体1，用于向胞内转运铁离子。血浆中的Fe2+经铜蓝蛋白还原成Fe3+后与转铁蛋白(transferrin，TF)结合，随后TF-Fe3+锚定于转铁蛋白受体1上，将Fe3+转入细胞内[27]。进入胞内的Fe3+被前列腺跨膜上皮抗原3还原成Fe2+，再通过二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)从转运内泌体释放到胞质之中[28-30]。铁蛋白是一种能结合铁离子的稳定蛋白，在运输铁离子的同时维持Fe3+/Fe2+的平衡，减少不稳定铁离子的蓄积[31-32]。进入胞质后的Fe2+可储存于铁蛋白之中，也可进入不稳定铁池执行其功能，如合成蛋白质、酶等[30]。跨膜转运蛋白铁蛋白1(ferroportin-1，Fpn1)是目前已知唯一可以向胞外运输铁离子的蛋白[33]。Fpn1与胞内的Fe2+结合后，将其转运到胞外。Fe2+在血浆中被还原为Fe3+并与转铁蛋白结合，至此完成铁离子的细胞内外代谢循环[34-35](如图1所示)。铁代谢紊乱会造成胞内铁离子含量异常，Fe2+超载引起胞内过氧化反应。1995年Winterbourn等[36]学者发现了Fe2+与过氧化氢反应可产生活性氧对广泛底物进行氧化，并将此现象命名为芬顿反应(fenton reaction)，此过程是Fe2+诱发铁死亡的经典途径；随后在2017年Gaschle研究团队提出了Fe2+是脂氧合酶的重要亚基，脂氧合酶能对胞内磷酯化PUFAs进行过氧化，触发铁死亡[37]。铁过载是铁死亡触发的“板机点”，探讨如何维持SAH早期脑损伤中的铁稳态具有重要意义。

3.2铁代谢通路与蛛网膜下腔出血早期脑损伤在SAH大鼠的72 h早期损伤中，调节铁代谢的关键因子铁调素、DMT1和Fpn-1均有显著变化[38]：铁调素、DMT1在早期损伤中持续上调，且在48 h和72 h上升最为明显；而Fpn-1则相反，其表达量随时间不断下降，在72 h下降明显。此外，GPx4的表达量变化与Fpn-1相同，在SAH损伤发生后的72 h内持续下降[38]，该现象提示铁死亡的铁代谢通路与SAH的早期损伤相关。在引入铁调素和DMT1的抑制剂后，SAH大鼠的脑水肿明显减轻，且神经功能和血脑屏障功能趋向正常；在机制上，铁调素和DMT1的抑制剂减少神经元胞质内铁离子和脂质过氧化物沉积，增加GPx4和谷胱甘肽含量[38]，通过降低胞内Fe2+水平从而抑制铁死亡发生发展，减轻SAH的早期损伤。

铁蛋白能在神经元胞内结合铁离子，减少不稳定铁离子的蓄积，其中铁重链蛋白1(ferritin heavy chain 1，FTH1)是作为铁储存池的关键蛋白。铁蛋白自噬是近期新发现的一种选择性自噬机制，在该过程中铁蛋白被运往溶酶体降解，随后释放不稳定铁离子[39]。SAH早期损伤中铁蛋白自噬同样发挥作用：在SAH的大鼠模型中，损伤发生后的72 h内FTH1持续下降，伴随胞质内Fe2+和脂质过氧化物蓄积，用腺病毒沉默自噬相关基因5可使SAH大鼠神经功能损伤、血脑屏障损伤及脑水肿减轻；同时，与模型组相比FTH1因自噬被抑制而表达增加，且Fe2+和脂质过氧化产物的蓄积均显著减少[40]。黄芩苷(baicalin)是一种类黄酮化合物[41]，研究发现黄芩苷可使早期损伤的SAH大鼠的SAH等级降低、神经行为学评分提高及脑水肿减轻，在进一步的机制探究中发现其可通过减少Fe2+的胞内沉积从而减少SAH大鼠脑内的脂质过氧化物和活性氧的蓄积；此外，黄芩苷可抑制SAH早期损伤发生后的自噬相关基因beclin-1和微管相关蛋白轻链3的表达[42]。然而，黄芩苷对铁蛋白表达的影响以及自噬与Fe2+沉积的相关性仍缺乏相关研究。铁蛋白自噬机制作为一种新的铁死亡机制，探讨其在SAH早期损伤中的作用有望发掘SAH的病理机制。

4 结 语

在多年的临床实践中，脑血管痉挛和迟发性脑缺血一直是SAH治疗的重点，至今尼莫地平仍是唯一被证明可以改善SAH不良预后的药物[43-44]。然而，随着介入造影和神经影像学的发展，学者们发现即使脑血管痉挛被逆转，SAH的临床转归也并不理想[45]，更多的特异性治疗需要被引入临床。随着对早期脑损伤机制的研究深入，SAH更多的致病机制和治疗靶点被发掘，铁死亡是其中的关键环节之一。铁死亡在近些年被证实与多种类型的卒中都密切相关[46-48]，并且铁死亡抑制剂在不同的脑血管疾病模型中都取得可观的效果，相比脑缺血/再灌注损伤和脑实质性出血，铁死亡在SAH方面的研究较少，但其与SAH早期脑损伤中破入蛛网膜下腔的含铁血红素、自发性炎症和过氧化环境的联系密不可分[24-25,49-51]，深入探讨SAH与铁死亡的联系对未来SAH的诊疗有十分重要的意义。