敲低Tudor-SN对血管平滑肌细胞增殖迁移和凋亡的影响

刘明霞，马锦征，苏 超，杨 洁，魏民新

0 引 言

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是心血管疾病中的常见病，致死率很高。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前临床冠心病治疗的主要方式，可有效改善冠状动脉的狭窄及梗阻，降低死亡率，但仍然面临着术后血管内再狭窄的问题[1-3]。研究发现，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的表型转化是导致血管狭窄的主要原因。当血管受到机械或病理性损伤时，血管中膜的VSMC将会发生表型转化，由收缩型转变为增殖型并迁移到血管腔内形成新生内膜，进而导致血管狭窄。VSMC具有高度的可塑性，在生理发育过程中或病理状态会发生表型转化。它们在胚胎发育过程中处于增殖表型，但在成年期中保持静止分化的状态。当受到压力或病理刺激时，高度分化的VSMC会发生表型转化重新进入细胞周期，其增殖和迁移能力会大大增加[4]。VSMC的表型转化及异常增殖是很多心血管疾病的重要致病机理，因此，深入研究VSMC表型转化的分子机制，将有助于我们进一步了解血管狭窄的发生发展过程并为预防手术治疗后的血管再狭窄提供新思路。

Tudor-SN蛋白，也称为p100或SND1蛋白(Saphylococcal Nuclease Domain containing 1)，是一种高度保守的多功能蛋白质[5-6]，在基因转录、pre-mRNA剪接、脂肪生成、细胞周期调控和DNA损伤反应等方面均发挥重要作用[7-9]。此外，Tudor-SN的波动性表达与心肌细胞的发育及成脂分化过程密切相关[10-11]。VSMC是高度分化的细胞，但在病理因素等刺激下会发生从静息收缩型向增殖活跃型的表型转化，作为与细胞增殖、周期调控密切相关的蛋白，Tudor-SN在其中的表达是否发生改变依旧未知。课题组前期动物模型结果表明，Tudor-SN在正常VSMCs中几乎不表达，而在血管损伤后VSMC增殖迁移形成的新生内膜中表达增加，这表明Tudor-SN可能参与血管损伤过程中VSMC的表型转化。因此，本研究通过制备靶向敲低Tudor-SN的shRNAs重组慢病毒稳定株，观察敲低A7R5细胞中Tudor-SN蛋白对VSMC增殖、迁移和凋亡的影响，为VSMC的表型转化中Tudor-SN的作用研究提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料TRC-2 pLKO-puro质粒，病毒包装质粒由天津医科大学石磊教授实验室惠赠；A7R5大鼠血管平滑肌细胞购买于ATCC；人肾上皮细胞293T为本实验室保存；限制性内切酶AgeⅠ，EcoRⅠ，T4 DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶(NEB)，T4多聚核苷酸激酶缓冲液(10×NEB Buffer)，BCA蛋白测定试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；Trans 2K plusⅡ DNA Marker，Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒，去内毒素质粒提取试剂盒购自Biomiga公司；DMEM高糖培养基，FBS血清购自BI公司；RIPA裂解液，嘌呤霉素购自北京索莱宝科技有限公司；鼠源Tudor-SN抗体本实验室自制；α-Tubulin抗体购自Sigma公司；α-SMA抗体购自abcam公司；OPN抗体购自Proteintech公司；生长因子PDGF，购自RD公司；辣根过氧化物酶标记的抗鼠源IgG二抗购自Fermentas公司；Beyo ECL Plus超敏化学发光试剂盒购自碧云天公司；Cell counting kit 8试剂盒，细胞凋亡检测试剂盒购自上海同仁化学公司；shRNAs序列引物合成，质粒测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2构建pLKO-Tudor-SN-sh重组表达质粒①通过网站http://rnaidesigner.thermofisher.com和http://sirna.wi.mit.edu预测大鼠Tudor-SNshRNA序列，选定了两条序列为大鼠Tudor-SNshRNA序列：shRNA 1，shRNA 2，分别为Tudor-SN-sh 1：5′-CCGGGGCCAGAGCTATTAAGAATCTCGAGATTCTTAATAGCTCTGGCCTTTTTG-3′；Tudor-SN-sh 2：5′-CCGGAGCTCAAGCCACAGAGTATGCCTCGAGGCATACTCTGTGGCTTGAGCTTTTTTG-3′。②采用Fast DigestAgeⅠ和Fast DigestEcoRⅠ，按照说明书要求的浓度酶切载体TRC-2 pLKO-puro，使用胶回收试剂盒回收酶切产物。③将合成的两条互补的引物退火形成双链，PCR程序为：95 ℃：4 min；70 ℃：10 min；随后以0.3 ℃/min一直降到25 ℃,16 ℃终止。④将载体与退火引物双链连接，转化进感受态细胞，涂板，第2天挑取单菌落摇菌，菌液进行PCR并送去公司进行测序鉴定。⑤提取质粒，甘油保种，于-80 ℃冰箱冻存以便后续使用。

1.3A7R5细胞pLKO-Tudor-SN-sh稳定表达株的构建及鉴定①pLKO-Tudor-SN-sh慢病毒质粒包装：培养293T细胞汇合率达90%时，使用转染试剂PEI将包装质粒及pLKO-Tudor-SN-sh和pLKO-Vector质粒按一定比例共转染到293T细胞中，分别在24 h及48 h后收集细胞上清液过滤以备后续使用。②A7R5细胞pLKO-Tudor-SN-sh稳定表达株的构建：正常培养A7R5细胞，分为对照组和实验组，实验组感染病毒液pLKO-Tudor-SN-sh和pLKO-Vector，对照组不做处理，感染48 h后两组加入相应浓度的嘌呤霉素进行阳性筛选。待对照组A7R5细胞全部死亡时，停止加药，实验组即为pLKO-Tudor-SN-sh和pLKO-Vector稳定表达株。③A7R5细胞pLKO-Tudor-SN-sh稳定表达株的鉴定：采用Western Blot鉴定A7R5细胞中Tudor-SN的表达，提取蛋白，BCA法测总蛋白浓度后取10 μg，以α-Tubulin作为内参，实验室自制Tudor-SN抗体孵育，曝光。

1.4CCK-8实验常规培养A7R5 pLKO-Vector及pLKO-Tudor-SN-sh细胞，待其汇合率90%时，使用胰酶消化，细胞计数，以每孔3000个细胞接种到96孔板中，为保证实验准确性，每个样品每孔做6重复，第2天弃掉原培基，每孔加入含10 μL CCK-8试剂的100 μL DMEM，同时为排除DMEM培基的影响设置1个Blank对照。加完后置于37 ℃，5% CO2孵箱培养3 h，待颜色变为橙黄色后上机检测A450值。每天相同时间点，间隔相同时间检测1次，重复6 d，汇总结果进行统计分析。

1.5免疫荧光实验常规培养A7R5 pLKO-Vector及pLKO-Tudor-SN-sh细胞，待其汇合率90%时，消化接种到24孔板里，使细胞密度约为50%～60%。隔天弃去培基用PBS洗2遍，使用多聚甲醛固定10 min，PBS洗2遍，加入0.2% Triton-100透化10 min，PBS洗2遍，使用1% BSA封固，在4 ℃摇床过夜孵育Ki67抗体，PBS洗3遍，每次10 min，避光孵育荧光二抗8 h，DAPI染色3 min，PBS洗3遍，每次3 min，荧光显微镜下拍照观察。

1.6划痕实验正常培养A7R5 pLKO-Vector及pLKO-Tudor-SN-sh细胞，待其汇合率90%时，将其接种于6孔板常规培养，接种量以过夜后100%融合为佳，本实验中选择5×105个细胞/孔。隔天早上，使用20 μL移液枪头划痕，以中间线两边对称每孔垂直划痕3条。小心弃掉原培养基，用PBS轻轻洗1遍。加入含1% FBS的DMEM低血清培养基，12 h后在显微镜下观察细胞划痕愈合情况，拍照记录。

1.7凋亡实验在6 cm皿里常规培养pLKO-Vector及pLKO-Tudor-SN-sh细胞，给予细胞1% FBS低血清刺激24 h，吸取上清液到15 mL离心管，加入常温PBS冲洗2次，同样收集到15 mL离心管。用胰酶消化细胞，终止消化后转移到15 mL离心管中。室温下500×g，5 min离心，弃上清。加入1 mL PBS重悬清洗1次。离心后再次加入1 mL PBS重悬细胞，取出一部分收集蛋白和RNA。剩余部分弃上清，每孔加入预先配好的1×Annexin V Binding Solution(100 μL)，制成终浓度为1×106cells/mL 的细胞悬液。向细胞悬液中加入5 μL Annexin V，FITC结合物，再加入5 μL PI，室温下避光培养15 min。加入配好的剩余的400 μL×Annexin V Binding Solution，1 h内上机检测。

1.8PDGF诱导VSMC表型转化①在6 cm皿中培养A7R5 pLKO-Vector及pLKO-Tudor-SN-sh细胞稳定株各3皿，分为2组，待其生长到融合度为70%左右时，使用1% FBS DMEM将细胞饥饿24 h；②之后一组细胞继续饥饿，另一组细胞加入40 ng/mL的PDGF刺激24 h；③同时收取2组6皿细胞，加入RIPA裂解液，裂解超声，使用Western Blot进行蛋白的检测。

2 结 果

2.1 pLKO-Tudor-SN-shRNAs重组慢病毒表达质粒酶切鉴定结果使用AgeI、EcoRI对质粒pLKO-Tudor-SN-shRNAs进行酶切，使用Trans 2K plus Ⅱ DNA Marker作为参照进行琼脂糖电泳，条带与理论值相符，质粒已被酶切，见图1。

M：marker；1：pLKO-Tudor-SN-sh 1；2：pLKO-Tudor-SN-sh 1酶切后；3：pLKO-Tudor-SN-sh 2；4：pLKO-Tudor-SN-sh 2酶切后

2.2Western blot检测A7R5敲低稳定细胞株中Tudor-SN蛋白的表达使用病毒液感染A7R5细胞，48h后收取蛋白进行Western Blot实验，结果表明与pLKO-Vector稳定株相比，pLKO-Tudor-SN-sh 1和2稳定株中Tudor-SN的表达明显降低，见图2。结果说明A7R5细胞中pLKO-Tudor-SN-sh 1和sh 2稳定株构建成功。

1：pLKO-Vector；2：pLKO-sh Tudor-SN-sh 1；3：pLKO-sh Tudor-SN-sh 2

2.3CCK-8实验检测敲低Tudor-SN对细胞增殖的影响由图3可以看出，细胞接种的前2 d对照组和实验组细胞的增殖未见明显差异(P>0.05)，从第3天起，pLKO-Tudor-SN-sh细胞明显慢于pLKO-Vector细胞，在培养的第4-6天，差异更加明显(P<0.05)。表明在A7R5中敲低Tudor-SN，细胞的增殖明显受到抑制。

与pLKO-Vector同时间点比较，*P<0.05、**P<0.01

2.4免疫荧光实验检测敲低Tudor-SN后 Ki67的变化由图4可以看出，使用Ki67抗体对A7R5稳定株细胞进行染色，与pLKO-Vector相比，在同样的拍照条件下，pLKO-Tudor-SN-sh1和sh2的细胞绿色荧光强度明显降低。

图 4 镜下观察Ki67的变化(免疫荧光染色 ×40)

2.5划痕实验检测敲低Tudor-SN对A7R5细胞迁移的影响划痕实验结果表明，给予细胞划痕12 h后，对照组pLKO-Vector愈合较快，细胞迁移面积为2.7 μm2，实验组敲低Tudor-SN后愈合能力明显减弱，pLKO-Tudor-SN sh 1细胞和pLKO-Tudor-SN sh 2细胞迁移面积(1.6、1.7 μm2)均降低(P<0.01)。见图5。

图 5 划痕实验检测细胞的迁移能力

2.6流式细胞术检测敲低Tudor-SN对A7R5细胞凋亡的影响正常培养条件下，与对照组pLKO-Vector相比，敲低Tudor-SN后的凋亡水平差异无统计学意义(P>0.05)。使用1% FBS对细胞进行饥饿处理24 h后，与对照组相比，敲低Tudor-SN后细胞凋亡比例明显升高(P<0.01)。见图6，表1。

a：对照组；b：实验组

表 1 不同组细胞凋亡比较(%)

2.7Tudor-SN的敲低降低了PDGF诱导的VSMC表型转化由图7可知，敲低Tudor-SN后，增殖相关基因OPN表达降低，收缩相关基因α-SMA表达增加(lane2，lane3)，表明敲低Tudor-SN抑制了VSMC表型转化，使VSMC由增殖型向分化型转变；PDGF是一种经典的诱导VSMC表型转化的细胞因子。当给予细胞40 ng/mL PDGF刺激后，OPN表达上调，α-SMA表达下调，说明PDGF诱导细胞发生了表型转化，Tudor-SN的蛋白表达水平增加(lane1，lane4)，表明Tudor-SN参与了VSMC表型转化；同时敲低Tudor-SN减弱了PDGF诱导的VSMC表型转化，表明Tudor-SN对VSMC表型转化可能发挥促进作用。

1-3:分别为对照组；4-6：分别为实验组

3 讨 论

随着社会老龄化进程的加速，心血管疾病成为危害人类健康的首要病因，冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是心血管疾病中的常见病，致死率最高[12]。针对冠心病的治疗，腔内介入及旁路血管移植术是目前临床上的主要手段。这两种治疗方法虽然均能获得较好的近期疗效，但长期预后却受到冠脉再狭窄的制约[13]。研究发现，VSMC的表型转化及异常增殖是冠状动脉腔内介入治疗后再狭窄以及旁路血管移植术后内膜增生等发生发展的重要致病机制之一[14]。

VSMC位于大动脉的血管中层，根据形态和功能分为两类[15]：一类是收缩型(又称分化型)，生理状态下，收缩型VSMC处于静息状态，是一类终末分化细胞，不易增殖和迁移，具有良好的收缩功能；另一类是增殖型(又称合成型)，是一类去分化的较原始的VSMC，具有分泌、迁移和增殖功能，但却难以发挥其收缩作用[15]。当VSMC受到机械损伤、缺血损伤、脂质沉积以及多种细胞因子等刺激时，均可发生表型转化：由收缩功能为主的静息状态转变为“低收缩，高增殖”的活化合成状态[16]，并通过不同的信号通路与氧化应激、血管重塑及免疫炎症反应等生物学行为建立密切联系，形成一个庞大而复杂的调控网络，在血管狭窄过程中发挥重要作用。因此，深入研究VSMC表型转化及异常增殖的分子机制，为认识冠脉狭窄的发生发展过程和预防手术治疗后的血管再狭窄起到重要作用。

Tudor-SN蛋白在增殖的细胞和组织中高表达，在分化或者静止期细胞中低表达。它是一种多功能蛋白，在肿瘤的发生发展中发挥着作用[17-18]。Tudor-SN蛋白作为转录因子E2F1的共激活因子，增强S期基因的转录活性，进而促进细胞周期G1期向S期的进程[8]。Tudor-SN蛋白还通过抑制Micro-RNA降解，促进G1/S期细胞进程[20]。此外，Tudor-SN还与TGF-β交互调控，一方面，在TGF-β通路中，Smad2/3与Tudor-SN启动子区结合，促进下游Smurf1的表达，导致RhoA的泛素化和降解[21]。另一方面，Tudor-SN能够识别Smad启动子区并且招募GCN5，促进Smad基因转录，调控TGF-β/Smad通路，两者互为正反馈调控，进而促进乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭[21]。VSMC的表型转化是一个从分化型向增殖型转变，并且增殖和迁移能力增强的过程，那么Tudor-SN是否在VSMC中发挥作用，目前尚未有研究报道，也是我们未来关注的重点。

本研究一方面通过在大鼠血管平滑肌细胞系A7R5中敲低了Tudor-SN蛋白，观察到了细胞的增殖和迁移能力的降低，并且还发现了凋亡能力的增加，这提示Tudor-SN可能在VSMC表型转化中发挥着重要作用；另一方面使用PDGF诱导VSMC表型转化，检测到敲低Tudor-SN减弱了PDGF诱导的VSMC表型转化，表明Tudor-SN在VSMC表型转化中可能发挥促进作用。A7R5 pLKO-Tudor-SN-sh细胞的构建成功，为进一步研究Tudor-SN参与VSMC表型转化的具体机制提供了细胞模型，同时为研究病理性疾病损伤导致的VSMC异常的增殖，以及PCI术后血管再狭窄过程中Tudor-SN的作用奠定了基础。