基于多波长高效液相色谱指纹图谱和多成分定量分析的益肝明目口服液质量标准研究

谢百波，里艳茹，寻园，臧新钰，李映，苏加乐，程林友，周骅*（. 北京慧宝源生物技术股份有限公司，北京 02206；2. 广西慧宝源医药科技有限公司，广西 钦州 535008；3. 抗肿瘤药物国家地方联合工程研究中心，广西 钦州 535008）

中药口服液是目前广受欢迎的中成药剂型，其药效的发挥是多成分共同作用的结果，药效成分的含量和比例对疗效有重要影响。因此，在评价其质量时，需采用能更全面反映其内在品质的方法，比如指纹图谱[1-7]，结合多指标成分的含量测定[8-10]。益肝明目口服液是在古方“固根汤”[11]的基础上加味所得，主要由玉竹、当归、白芍、熟地和麦冬等12 味中药组成，具有补益肝肾的作用，适用于肝肾不足症见腰膝酸软、头晕目糊、记忆力减退、体倦乏力等[12]。研究表明，益肝明目口服液对异烟肼联合利福平诱导的大鼠药物性肝损伤[13]和大鼠急性酒精性肝损伤[14]均有较好的保护作用。益肝明目口服液现有标准的含量测定项仅对芍药苷的含量进行了相应规定，只能反映药品中药材白芍的情况，比较片面[15]。为了更加全面地评价该药品的质量，完善其质量标准，本研究建立了该产品的多波长HPLC 指纹图谱，并对其中6 个成分（芍药苷、绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷）进行含量测定，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（包含Labsolution 工作站，SIL-20A 自动进样器，SPD-M20A 二极管阵列检测器，日本岛津公司，型号：20A）；MS105DU电子天平（Mettler Toledo）；KQ-500DE 超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

益肝明目口服液（广西慧宝源医药科技有限公司）；乙腈（Honeywell，HPLC 级）；甲醇、磷酸、正丁醇（北京化工厂，分析级）。阿魏酸（批号：12112204）、绿原酸（批号：13031401）、木犀草苷（批号：13060908）、川陈皮素（批号：13122311）、橙皮苷（批号：14010315）和芍药苷（批号：13113009）（对照品，成都曼思特生物科技有限公司，质量分数均大于98%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Inertsil ODS-SP 色谱柱（250 mm×46 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～25 min，5%～15%A；25 ～35 min，15% ～20%A；35 ～55 min，20% ～30%A；55 ～70 min，30% ～70%A；70 ～90 min，70% ～100%A）； 体积流量 0.8 mL·min-1， 检测波长190 ～600 nm， 柱温35 ℃，进样量10 μL。

2.2 供试品溶液制备

精密量取益肝明目口服液1 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，称定重量，超声处理10 min（功率100 W，频率40 kHz，温度20℃），静置至室温后，称定重量，甲醇补足损失的重量，即得供试品溶液（在制备后24 h 内检测）。

2.3 对照品溶液制备

取阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、橙皮苷、芍药苷、木犀草苷对照品各适量，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得阿魏酸415 μg·mL-1、绿原酸222 μg·mL-1、川陈皮素192 μg·mL-1、橙皮苷966 μg·mL-1、芍药苷494 μg·mL-1和木犀草苷19.0 μg·mL-1的对照品溶液。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取批号为130829 的益肝明目口服液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6 次，使用中药指纹图谱相似度评价系统（2012）计算相似度，相似度RSD为0.64%，说明方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取批号为130829 的益肝明目口服液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行操作6 份，进样测定，计算相似度RSD为0.17%，说明方法重现性良好。

2.4.3 稳定性试验 取批号为130829 的益肝明目口服液，按照“2.2” 项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，计算相似度RSD为0.08%，说明样品在24 h 内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立及共有峰的指认

分别取12 批益肝明目口服液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，将12批样品的图谱以AIA 格式依次导入中药指纹图谱相似度评价系统（2012）进行分析，采用中位数法对相关参数进行自动匹配，标定出共有峰，根据色谱峰共有模式生成对照指纹图谱R，并生成12 批益肝明目口服液的指纹图谱，见图1。通过谱图对比，选择特征明显的色谱峰进行标定，在230、284、325、348 nm 波长下分别标定了22、20、31、32 个共有峰（见图1）。

图1 12批益肝明目口服液在不同波长下的指纹图谱Fig 1 Fingerprint of 12 batches of Yigan Mingmu oral liquid at different wavelength

2.6 相似度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 版）分析软件，以130102 批样品的HPLC图谱为对照，进行整体相似度评价。结果显示，4个波长下12 批益肝明目口服液相似度均大于0.91，表明样品批间差异较小，质量稳定，结果见表1。

表1 12批益肝明目口服指纹图谱相似度评价结果Tab 1 Similarity of 12 batches of Yigan Mingmu oral liquid

2.7 聚类分析

以12 批益肝明目口服液在4 个波长下共有峰的相对峰面积为原始数据，应用SPSS 22.0 软件，采用组间平均数联结法进行聚类分析。结果显示，12 批益肝明目口服液可聚为一大类。

2.8 含量测定方法学考察

2.8.1 专属性试验 精密吸取混合对照品、供试品、阴性样品（甲醇）溶液各10 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，结果见图2。样品在与对照品阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、橙皮苷、芍药苷和木犀草苷相应的位置上，均有相同保留时间的色谱峰，而阴性样品（空白溶剂）无对应色谱峰（图谱未再给出），说明该色谱条件不干扰测定。

图2 对照品（A）和供试品（B）HPLC 图谱Fig 2 HPLC chromatogram of blank solvent，mixed reference （A）and samples（B）

2.8.2 线性关系考察 根据样品中不同成分的含量，将对照品分别稀释成适宜的浓度，并配制系列标准曲线工作液，滤过，分别进样10 μL，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线，进行线性回归，结果见表2。

表2 6种指标成分的线性关系考察结果Tab 2 Linearity and ranges of 6 chemical markers

2.8.3 精密度试验 取混合对照品溶液连续进样6 次，测定其峰面积，结果阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、木犀草苷、橙皮苷、芍药苷的RSD分别为1.1%、0.72%、0.30%、1.0%、0.84%、1.5%，表明仪器精密度良好。

2.8.4 重复性试验 取批号为130420 的益肝明目口服液，按照“2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，进样测定，结果阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、木犀草苷、橙皮苷、芍药苷的RSD分别为1.7%、2.9%、1.5%、1.0%、2.8%、1.7%，表明方法重现性良好。

2.8.5 稳定性试验 取批号为130420 的益肝明目口服液，按照“2.2” 项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，结果阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、木犀草苷、橙皮苷、芍药苷的RSD分别为0.46%、2.4%、1.9%、1.2%、0.7%、1.8%，表明样品在24 h 内稳定。

2.8.6 回收试验 取已知含量的130420 批次的益肝明目口服液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，加入与样品含量约1∶1 的对照品溶液，平行操作6 份，进样测定，计算回收率。结果阿魏酸、川陈皮素、绿原酸、木犀草苷、橙皮苷、芍药苷的平均回收率分别为99.26%、102.95%、102.68%、101.66%、101.75%、97.03%，RSD分别为2.4%、2.7%、2.0%、2.1%、0.31%、0.41%，表明方法准确度良好。

2.9 含量测定结果

取12 批益肝明目口服液，按照“2.2” 项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果见表3。

表3 12批样品中6 个成分的含量测定结果(n ＝3，μg·mL-1)Tab 3 Contents of 6 markers in 12 batches of samples(n ＝3，μg·mL-1)

3 讨论

本研究比较了水饱和正丁醇萃取法和甲醇提取法制备供试品溶液。经比较发现，水饱和正丁醇萃取法中芍药苷的含量高于甲醇提取法，而其他5 种成分的含量均低于甲醇提取法，故选择甲醇超声处理供试品溶液。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%醋酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.05%甲酸水溶液5 种流动相系统，综合考虑峰形、分离度、出峰数等因素选择乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相。

本研究通过二极管阵列检测器（DAD）在190 ～600 nm 波长下对样品进行全波长扫描，并对各波长下的色谱行为进行分析。结果发现绿原酸、阿魏酸和川陈皮素在4 个波长（230、284、325、348 nm）处均有较强吸收峰，结合供试品图谱出峰情况，从谱图信息最大化考虑选择325 nm作为这3 个成分含量测定的共同检测波长；芍药苷在230 nm 处、橙皮苷在284 nm 处、木犀草苷在348 nm 处有较强吸收峰，在其他波长下吸收峰较弱，阿魏酸在4 个波长下都有紫外吸收，在325 nm 和348 nm 波长下吸光度较强，在230 和348 nm 波长下吸收峰面积较弱，因此选择不同波长作为相应成分含量测定的检测波长。

益肝明目口服液组方包括12 味药材，成分复杂，采用单一波长检测会出现色谱峰组成单一，特征峰信息的丢失或残缺，且难以涵盖全方所有药味。本试验采用了230、284、325、348 nm 为检测波长，建立了多波长指纹图谱和多成分含量测定方法，使各个色谱峰得到较好的分离，特征峰明显且峰形较好，尽可能多地获取色谱峰组成信息以更好地了解益肝明目口服液的化学组成。同时，方法学考察结果表明，本研究建立的指纹图谱和含量测定方法，重复性好，方法可靠，可以为完善该药品质量标准提供依据。

对于建立复杂中成药样品的HPLC 指纹图谱，可采取多种策略，如多波长融合指纹图谱、不同极性部位的指纹图谱等[16-18]。在条件允许的情况下，将HPLC-MSn研究和活性测定结合起来，对复杂中成药的质量控制更有意义[19-20]。希望将来能更加深入地研究益肝明目口服液的谱效关系，进一步完善该产品的质量标准。