五味子藤总木脂素抗氧化活性研究

2022-08-06乔巍郭娜张颖智崔玉海魏淑梅接伟光

生物化工 2022年3期

乔巍，郭娜，张颖智，崔玉海，魏淑梅，接伟光*

（1.黑龙江东方学院，黑龙江哈尔滨 150066；2.哈尔滨首智生物技术有限公司，黑龙江哈尔滨 150016）

五味子（Schisandra chinensis）作为一味传统中药材，主要入药部位是其成熟果实。木脂素是广泛分布在植物中的小分子量次生代谢产物，是五味子主要的活性物质，具有抗氧化、保肝、抗炎等作用。北五味子藤茎是五味子的干燥藤茎，经证实，五味子藤茎中存在有效成分——木脂素，可发挥与其果实相似的药理作用。

抗氧化功能评价主要包括体内评价和体外评价。体外评价包括化学评价法和生物活性评价法，且已经形成系统的体系。化学评价法以其原理简单、费用低廉、快速简便等优势广泛应用于抗氧化活性物质的初筛阶段，主要包括体外总抗氧化能力测定法（T-AOC）、清除各类活性氧自由基法（·OH、·O2-）、清除自由基法（DPPH法、ABTS法、ORAC法）。根据实验材料及目的，本文选用化学评价法中具有代表性的总抗氧化能力试剂盒及对超氧阴离子自由基清除效果两种方法评价五味子藤总木脂素抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器

BS124S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.1.2 试剂与材料

95%乙醇，分析纯，天津市光复科技发展有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，郑州和成新材料科技有限公司；VC对照品（批号：O19EB100374）、焦性没食子酸（批号：C14A9C58726），上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（批号：2020/11），北京博奥拓达科技有限公司。

五味子藤总木脂素固形物：原料为五味子藤，以95%乙醇为提取溶剂，通过加热回流法在料液比1∶10、提取次数3次、提取时间5 h条件下提取制得粗提液，再经AB-8大孔树脂在上样浓度1.5 mg/mL、吸附速率2 BV/h、上样量6 BV、95%浓度乙醇洗脱、洗脱速率2 BV/h、洗脱剂用量8 BV条件下纯化后干燥制得（BV为树脂床体积）。

1.2 方法

1.2.1 原理

（1）总抗氧化能力

Fe3+可以被样品中的抗氧化物质还原成Fe2+，Fe2+可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过紫外分光光度计进行测定[1-2]。

（2）超氧阴离子自由基清除力

邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，能产生稳定浓度的·O2-和有色中间产物。由于自氧化的速率与·O2-的浓度相关，消除·O2-则抑制自氧化反应，阻止氧化产物的积累，因此可以通过测定某一波长吸光度值的线性积累评价受试样品清除·O2-的能力[2-5]。

1.2.2 T-AOC测定

将总木脂素固形物配制成浓度为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的溶液，取上清液0.1 mL作为供试品溶液。配制浓度0.2 mg/mL的VC溶液作为对照品溶液。

按照T-AOC试剂盒（比色法）操作步骤，采用紫外分光光度法，在520 nm处测定各溶液吸光度值，每组实验重复3次。以总抗氧化能力单位（U）为指标计算各浓度供试品溶液和对照品溶液的总抗氧化能力，如公式（1）。

式中，ODt和ODc分别为试剂盒中测定管和对照管吸光度；V1和V2分别为配置溶液总量和取样量，mL；f为稀释倍数；TA为总抗氧化能力，U/mg。

1.2.3 超氧阴离子自由基清除力测定

（1）分别标记空白管、对照管、VC对照管和0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL的3个浓度样品管。空白管和对照管中加入4 mL蒸馏水，VC对照管加入0.2 mg/mL的VC对照品4 mL，样品组各加入对应浓度的4 mL样品溶液。（2）向（1）中各管加入0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.2）4.5 mL，25 ℃水浴20 min。（3）空白管加入0.5 mL蒸馏水，其余各管加入3 mmol/L邻苯三酚溶液0.5 mL，充分振摇后立即测定320 nm处吸光度值，以空白管调零。每30 s测量1次，共10次，记录时间和对应的吸光度值，每组实验重复3次。（4）以时间t为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制曲线，得回归方程，直线斜率V为吸收速率。抑制率IC的计算方法如公式（2）所示。