滇黄精的组织培养研究

伍灿明，刘春凉

（玉林师范学院，广西玉林 537000）

滇黄精（Polygonatum kingianumColl. et Hemsl.）系百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物，主要分布在云南省、广西壮族自治区等地，生长在海拔2 000～3 900 m的阴湿林地和灌木丛中[1]，其根状茎、种子等器官均可作为外植体。前人对丛生芽诱导增殖和生根培养的研究较少，且增殖系数和生根系数均不理想。本文以种子诱导萌发的幼苗为材料，并不断优化丛生芽诱导增殖培养基和生根培养基，以提高丛生芽增殖及和生根系数，为滇黄精种苗快速繁育提供依据[2-5]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滇黄精果实采自九万大山（东经108°35'32''～108° 48'49''，北纬 25° 01'55''～ 25° 19'54''）的野生材料，滇黄精的果实呈绿色，果实椭圆形、圆形、豆粒大小，大小均匀，色泽光亮。滇黄精种子比较小，被3个心皮包裹在果实内。

1.2 试剂与仪器

6-苄基氨基嘌呤，纯度≥99%，上海泽叶生物科技有限公司；萘乙酸，纯度95%，安阳全丰生物科技有限公司；赤霉素，纯度≥90%，酷尔化学科技（北京）有限公司；所有试剂均为化学纯。

YXQ-LS-75II型高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JZ-Ⅱ接种器械灭菌器，济南普朗特生物科技有限公司；SW-CJ-JC型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 滇黄精种子的预处理和消毒试验

将滇黄精果实置于流动自来水下冲洗5 h后，先用0.3 g/L高锰酸钾进行表面初步消毒，接着用0.1%赤霉素浸泡8 h打破休眠状态。将预处理的滇黄精果实用75%的酒精浸泡并不停地摇晃30 s，然后用无菌水清洗3～4次；再用0.1%的升汞深度消毒15 min，摇晃，弃去升汞后用无菌水清洗3～4次，再用解剖刀去掉外皮（注意不能伤及种子），接种到初步萌发培养基：MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+活性炭0.2 g/L，培养基中含蔗糖25 g/L、琼脂粉5 g/L，pH=7.0（下同）。每瓶接种6颗种子，处理5瓶，3次重复，40 d后统计污染率和萌发率。

1.3.2 不同光照强度对滇黄精种子萌发的影响

消毒后的滇黄精种子接到不同光照处理和不同浓度NAA外源激素处理的MS培养基中，12 d后观察种子萌发情况。

1.3.3 不同基础培养基对丛生芽诱导的影响

将长势良好的滇黄精幼苗分别接种于不同浓度的6-BA、NAA不同配比外源激素进的MS培养基上，各处理的培养基均加活性炭粉0.5 g/L。每瓶接入4棵幼苗，每个处理8瓶、3次重复，45 d左右统计丛生芽增殖情况。丛生芽的诱导率计算公式如下：

1.3.4 不同NAA浓度对丛生芽诱导的影响

配制6-BA浓度均为0.4 mg/L，以0.2 mg/L为一个梯度设置NAA的浓度梯度的MS培养基，选取长势良好、长有2～3片叶子的滇黄精幼苗，每瓶接入4棵幼苗，每个处理8瓶、3次重复，每10 d记录1次每个培养基中滇黄精幼苗的高度、叶片颜色和丛生芽生长情况。

1.3.5 滇黄精丛生芽生根的初步探究

选取大小相似，生长程度相近的丛生芽接种于加入不同浓度的6-BA、NAA这2种外源激素进行配比的MS培养基，各处理的培养基均加入活性炭粉0.5 g/L。每瓶接种4个根状茎，每个处理接种8瓶，30 d后统计生根情况。

1.4 培养条件

培养室温度调节在23～27 ℃，光照强度在2 000～3 000 Lx，光照时间为14 h/d。

2 结果与分析

2.1 无菌接种与启动培养

滇黄精种子接种到启动培养基后逐渐萌发，培养30 d后，滇黄精种子萌发率可达90%以上，且长势良好。实验证明，以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+活性炭粉0.2 g/L，pH=7.0为滇黄精种子萌发的启动培养基，有较好的萌发率，能作为滇黄精种子无菌萌发的启动培养基。

2.2 不同光照强度对滇黄精种子萌发的影响

由表1可知，NAA浓度和添加活性炭粉的培养基对种子的萌发具有明显的促进作用，实验表明NAA浓度在0.6～1.0 mg/L，且进行遮光处理的种子萌发率高，萌发速度快。

表1 不同光照强度对滇黄精种子萌发的影响

2.3 不同基础培养基对丛生芽诱导的影响

由表2知，3种培养基中丛生芽的诱导率都比较低，而生长速度也缓慢。（1）号和（2）号培养基有部分小苗出现黄叶并逐渐死亡的现象，可能是培养基营养成分已经消耗完全，（3）号培养基中的幼苗均生长良好，但是丛生芽生长速度慢。

表2 不同基础培养基对丛生芽诱导的影响

2.4 不同NAA浓度对丛生芽诱导的影响

由表3可知，当NAA浓度在0.6～1.2 mg/L时，丛生芽诱导率提高，叶色较好。诱导过程较易出现褐化现象，但除培养基（1）外，本次实验没有出现褐化现象，只有几棵幼苗最后慢慢枯死。从总体来看，丛生芽诱导率还是比较低。后期还需要继续调整NAA和6-BA浓度，进一步探究滇黄精组培苗丛生芽诱导率高的最佳配方。

表3 不同NAA浓度对丛生芽诱导的影响

2.5 滇黄精丛生芽生根的初步探究

从表4实验结果可知，培养基（7）（8）（9）的平均根数最多，而且根的平均长度也较长。滇黄精的根长和根数随着NAA浓度和6-BA浓度的增加而增加，当6-BA为0.8 mg/L，NAA为0.5 mg/L时，滇黄精丛生芽的平均根树最多，平均根长最长。

表4 滇黄精丛生芽生根的探究结果

3 结论

先使用75%酒精浸泡消毒30 s，再用0.1% HgCl2浸泡15 min，达到种子污染率为零的效果。在无菌处理前使用赤霉素浸泡8 h可打破种子休眠，促进种子萌发。通过实验证实，MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂5 g/L+活性炭粉0.5 g/L，可作为滇黄精种子启动培养基，添加适量的活性炭粉和遮光处理模拟黑暗环境，可提高种子萌发速度。为避免滇黄精幼苗出现褐化或者死亡，应该及时更换培养基。

当6-BA浓度为0.4 mg/L时，探讨不同NAA浓度对丛生芽诱导的影响发现，各培养基幼苗长势均良好，只有几棵演变为白化苗最终死亡。查阅文献推测，MS培养基大量元素含量高，可能是总盐分、渗透压过高，使得滇黄精出现渗透失水，逐渐死亡。

在6-BA和NAA浓度逐步增加的培养基中，滇黄精的生根率达100%，根的生长更快更自然，幼苗也葱郁健壮。在滇黄精生根诱导中，NAA在0.2～0.5 mg/L，6-BA在0.4～0.8 mg/L有利于根的产生，后期还会进行增加其浓度观察是否会抑制根的生长。