新疆部分地区牛蜱传无浆体和环形泰勒虫调查

葛晓敏 ， 陈宋琴 ， 李才善 ， 郑会珍 ， 郭庆勇

(新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052)

蜱传病原(Tick-borne pathogens，TBP)是一类经蜱传播的病原，其中包括原虫、微生物等。原虫如泰勒虫(Theileria)、巴贝斯虫(Babesia)等；立克次体(Rickettsiales)如无浆体(Anaplasma)等[1-2]。无浆体是一种专性细胞内寄生的革兰阴性病原体，属于立克次体目(Rickettsiales)，无浆体科(Anaplasmataceae)，无浆体属(Anaplasma)，其广泛分布于世界各地，可造成动物的无浆体病。引起该病的主要病原有绵羊无浆体(Anaplasmaovis,A.ovis)、牛无浆体(Anaplasmabovis,A.bovis)等[3-5]；这些寄生菌的感染最终可导致温和型或严重型的无血红蛋白症和血红蛋白尿症状的贫血与黄疸等[6]。泰勒虫是泰勒虫属(Theileria)专性胞内寄生的原生动物，在牛上能引起热带或地中海泰勒虫病及东海岸热病等[7]。环形泰勒虫是主要病原之一，其感染症状有发热、贫血、羞明流泪、黄疸、淋巴组织增生等[8-9]。

蜱传病原都严重影响公共安全，危及动物福祉和畜主生计。本试验采集新疆吐鲁番、阿勒泰和伊犁州3个地区的牛全血样品(n=356)，利用PCR检测和统计分析方法，分别对3个地区的绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫3种病原在当地的感染情况进行了调查分析，旨在为后续的相关疾病流行病学调查研究及防控措施的建立提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 2018年7月—2021年5月采用牛颈静脉采血方式，共采集356份牛全血样品(n=356)，其中，吐鲁番地区155份(n1=155)、阿勒泰地区110份(n2=110)、伊犁州地区91份(n3=91)。将采集的牛全血放置于5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内，标记好后存放于4 ℃环境，备用。

1.1.2 主要试剂 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、pEASY-T1载体，均购自北京全式金生物技术有限公司；2×EcoTaqPCR Super Mix、DL-2 000 Marker，均购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒，均购自美国Axygen公司；DH5α感受态细胞，购自TaKaRa公司；病原检测引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要仪器设备 电热恒温水浴锅(型号为DK-600A)，购自上海一恒科学仪器有限公司；紫外凝胶成像仪(型号为 Gel Doc2000)、PCR仪，均购自美国Bio-Rad公司；台式高速离心机(型号为RADIAL20)，购自西班牙ORTO ALRESA公司；琼脂糖电泳仪(型号为 DYCP-31DN)，购自北京六一公司。

1.2 方法

1.2.1 牛全血DNA提取 按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取牛全血基因组DNA，并保存于-20 ℃冰箱，备用。

1.2.2 病原检测 通过DNAMAN和Premier 5.0软件设计1对牛的绵羊无浆体的特异性引物，并参考陈宋琴等[10]设计的牛无浆体和实验室已建立的环形泰勒虫的特异性引物，利用PCR方法对牛绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫进行检测。PCR扩增引物信息见表1。

表1 检测3种病原使用的引物信息Table 1 Primer details used for detection of three pathogens

以提取的牛全血基因组DNA为模板，分别用特异性引物进行绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫的目的基因片段扩增。PCR扩增体系均为：2×EcoTaqPCR Super Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火温度根据表1设定，退火时间30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min。扩增结束后，各取5 μL PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，20 min后观察电泳结果。将筛选出来的阳性样品剩余的45 μL PCR产物重新进行凝胶电泳，步骤同上，之后将阳性条带切下用DNA凝胶回收试剂盒进行回收和纯化，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.3 测序和系统发育分析 按照pEASY-T1 Cloning Kit 说明书将回收的目的片段3 μL与1 μL pEASY-T1载体连接，导入至50 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，加入LB液体培养基，摇匀。摇菌管倾斜放置于摇床内200 r /min，37℃培养1 h。离心弃上清液，沉淀混匀涂板，筛选阳性单菌落，获得重组质粒，将选取的菌株进行培养并提取质粒。以提取的重组质粒为模板使用相应的PCR引物进行鉴定，挑选PCR检测结果为阳性的重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序获取的绵羊无浆体、牛无浆体的16S rRNA和环形泰勒虫的Tams1基因序列在DNAMAN上进行比对，然后与NCBI GenBank数据库中登录的其他序列通过BLAST进行同源性比较。通过MEGA 7.0软件采用邻接(Neighbor-joining，NJ)法以统一模型分析并分别计算以上病原种间的遗传距离并构建系统发育树，Bootstrap值为1 000。

2 结果

2.1 3种病原的PCR检测 利用表1所示引物序列，以牛全血基因组DNA为模板进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳，分别出现了牛的绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫的目的片段，大小分别为500、351 bp和527 bp，电泳结果见图1。

图1 绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫的PCR检测Fig.1 PCR detection of A.ovis,A.bovis and T.annulataM:DL-2 000 DNA 相对分子质量标准； 1～7：检测样品； 8：阴性对照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-7:Test samples； 8:Negative control

2.2 单一病原感染情况 对采集的356份牛全血样品进行PCR检测，3种病原在不同地区单一感染情况见表2。结果显示，3个地区中绵羊无浆体的总感染率为21.9%(78/356)、牛无浆体总感染率为37.4%(133/356)、环形泰勒虫总感染率为41.6%(148/356)；其中，绵羊无浆体在阿勒泰地区的感染率最高(29.1%，32/110)，吐鲁番地区的感染率最低(14.8%，23/155)；牛无浆体在阿勒泰和伊梨州地区感染率相同，均为41.8%(46/110和38/91); 吐鲁番地区的环形泰勒虫感染率最高(43.2%，67/155)。运用SPSS软件中的单因素方差分析对3个地区病原单一感染情况进行差异显著性分析，结果表明，3个地区中牛单一感染绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫不存在显著性差异(P>0.05)。

表2 3种病原单一感染调查情况Table 2 Investigation of single infection with three pathogens

2.3 3种病原混合感染情况 对采集的356份样品进行PCR检测，混合感染情况见表3。结果显示，74头牛(20.8%，74/356)感染了2～3种病原(双重感染，n=63；三重感染，n=11)；最主要的双重混合感染病原体是牛无浆体和环形泰勒虫(78.4%，58/74)，其次是绵羊无浆体和牛无浆体(5.4%，4/74)；同时，有11头牛感染了绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫3种蜱传病原。

表3 3种病原混合感染情况调查Table 3 Investigation of mixed infection with three pathogens

2.4 测序及遗传进化分析 测序比对结果显示，绵羊无浆体、牛无浆体的16S rRNA和环形泰勒虫的Tams1基因与NCBI GenBank数据库中登录的其他地区分离株的同源性分别是98%～100%、96%～99%和95%～98%。系统发育树结果如图2所示，伊犁州绵羊无浆体与中国广西株(登录号：EF587237)和乌干达株(登录号：AF318945)同在一支，阿勒泰地区绵羊无浆体与中国甘肃株(登录号：AJ633049)同在一支，吐鲁番地区绵羊无浆体与中国浙江株(登录号：JN558818)同在一支；此外，伊犁州和阿勒泰地区的绵羊无浆体遗传距离较近，与吐鲁番地区较远。

图2 绵羊无浆体16S rRNA基因系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of A.ovis 16S rRNA gene▲：本试验测定的吐鲁番、阿勒泰和伊犁州的A.ovis 16S rRNA基因序列▲：Sequence of A.ovis 16S rRNA gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

阿勒泰与吐鲁番地区的牛无浆体分别与突尼斯株(登录号：KM401903)和中国陕西株(登录号：MN044717)处于同一支，伊犁州牛无浆体与俄罗斯株(登录号：MT036513)属同一支且亲缘关系近；阿勒泰和吐鲁番地区的无浆体遗传距离较近，与伊犁州较远，见图3。

图3 牛无浆体16S rRNA基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of A.bovis 16S rRNA gene▲：本试验测定的吐鲁番、阿勒泰和伊犁州的A.bovis 16S rRNA基因序列▲：Sequence of A.bovis 16S rRNA gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

吐鲁番和阿勒泰地区环形泰勒虫与埃及株(登录号：AB917279)在同一支，伊犁州环形泰勒与印度株(登录号：KP235484)属同一支；阿勒泰和吐鲁番地区的环形泰勒虫的遗传距离较近，与伊犁州较远，见图4。

图4 环形泰勒虫Tams1基因系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of T.anuulata Tams1 gene▲：本试验测定的吐鲁番、阿勒泰和伊犁州的T.annulata Tams1基因序列▲：Sequence of T.annulata Tams1 gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

3 讨论

新疆位于我国西北边陲，占总国土面积1/6，位于亚欧大陆腹地，与八国接壤，国际畜牧贸易频繁[1]，畜牧业是当地主要经济来源之一[11]。据前期文献报道，多个地区出现牛感染环形泰勒虫和无浆体等病原的病例[12]。新疆主要存在的无浆体病原有牛无浆体、绵羊无浆体和嗜吞噬细胞无浆体等[13]。其中，牛无浆体和绵羊无浆体流行最为广泛。Liu等调查发现，牛无浆体和绵羊无浆体的单一病原体感染率分别为16.0%和15.3%，高于嗜吞噬细胞无浆体感染率(6.1%)[14]。环形泰勒虫感染在新疆牛属动物中普遍存在，在全疆14个地州的感染率高达20.9%[15]。新疆是该病的高发地区之一，据当地畜牧兽医局统计，2010— 2012年因该病造成的牛只死亡率为24%[16]。

本试验使用PCR方法对新疆3个地区牛的绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫进行检测。结果发现，绵羊无浆体在阿勒泰地区感染率最高(29.1%，32/110)，吐鲁番地区感染率最低(14.8%，23/155)，该结果与张玉婷等[11]报道的新疆阿勒泰地区、巴州地区的绵羊无浆体感染率(27%)相近。环形泰勒虫在吐鲁番地区的感染率最高(43.2%，67/155)，阿勒泰地区感染率最低(40.0%，44/110)，据文献报道，吐鲁番地区环形泰勒虫病的总阳性率达49.5%(413/835)[16]，比本试验的检测结果略高。分析其主要原因可能是由于当地气候条件、媒介分布和样本量的差异等引起。Yang等[17]研究表明，新疆南疆绵羊无浆体的感染率为55.2%(69/125)。张晶等[18]对新疆南疆21个(市、县)地区637份羊血液样品进行检测，结果发现绵羊无浆体感染率为72.2%。本试验结果显示，吐鲁番、伊犁州和阿勒泰3个地区的牛血液样品中绵羊无浆体总感染率为21.9%，均比上述研究结果低；该结果表明绵羊无浆体可能存在跨宿主传播，且在不同种宿主间的感染率存在差异。

本试验结果还发现，有74头牛出现混合感染情况(双重感染，n=63；三重感染，n=11)，混合感染率最高的是环形泰勒虫和牛无浆体。此次检测地区养殖类型以散养为主，且大多家畜是混合饲养，这为蜱虫在各个动物间爬行吸血传播病原提供有利条件[1]，从而增加了家畜混合感染的可能性。用PCR方法针对牛绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫的16S rRNA和Tams1基因序列扩增，并在NCBI上进行比对，同源一致性结果分别为98%～100%、96%～99%和95%～98%。遗传进化分析结果显示，伊犁州和阿勒泰地区的绵羊无浆体亲缘关系较近，与吐鲁番地区亲缘关系较远；阿勒泰和吐鲁番地区的牛无浆体、环形泰勒虫的亲缘关系较近，与伊犁州地区亲缘关系较远。

本试验病原均为蜱传病原，一般在蜱吸血时将病原传播给家畜。有报道指出灭蜱计划在亚热带边缘地区已取得成功，扇头蜱分布在美国南部和阿根廷中部，这些地区的扇头蜱和巴贝斯虫病已得以根除，非洲南部的东海岸热病(由泰勒虫传播)已被消灭[19]。为了减少家畜被感染的风险，消灭蜱虫起到至关重要的作用。畜主应及时消灭家畜身上及环境中的蜱，或在蜱虫多发季节前加强对蜱虫的防控，试图切断病原传播途径，减少蜱传疾病的发生。