CRE耐药基因的流行情况与耐药情况*

汪一萍，倪剑锋，鲁 勇，应建飞，蒋 磊，史俊颖

1.宁波大学附属人民医院检验科，浙江宁波 315105；2.宁波基内生物技术有限公司，浙江宁波 315200

碳青霉烯类抗菌药物一直是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)或AmpC酶的肠杆菌科细菌治疗首选药物[1-2]。随着此类抗菌药物的广泛使用，临床耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率逐年升高，增加了临床用药的选择难度[3-4]。产碳青霉烯酶是形成CRE菌株的主要耐药机制，不同类型碳青霉烯酶具有不同的水解抗菌药物活性，其耐药谱也存在一定差异[5-6]。按照Ambler分子分类原则，编码碳青霉烯酶的耐药基因可分为A、B、D 3类[7]。本研究对2017—2020年临床分离的CRE菌株进行药敏试验、耐药基因鉴定，并对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)进行同源性分析，为CRE的耐药检测，以及预防和控制CRE的院内传播提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2017—2020年宁波大学附属人民医院临床分离的CRE 222株，作为对照的标准(或参考)菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2仪器与试剂 所用仪器主要包括全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)、恒温培养箱(上海恒一科学仪器有限公司)、荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、离心机及金属浴(德国Eppendorf公司)。主要试剂包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及3种碳青霉烯酶耐药基因(NDM、KPC和OXA-48)检测试剂盒(宁波基内生物技术有限公司)，美罗培南、亚胺培南、阿米卡星与环丙沙星等抗菌药物(中国药品生物制品检定所)。本研究中引物的合成和扩增产物测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.3CRE菌株鉴定及药敏试验 222株CRE菌株均使用全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定，并对各种抗菌药物的耐药率进行数据分析。

1.4CRE菌株的基因检测 (1)CRE菌株的荧光定量PCR检测：以CRE菌株DNA为模板，分别对两种常见细菌的基因进行检测，包括大肠埃希菌的特异性基因(ydij)和肺炎克雷伯菌的特异性基因(phoE)中3种常见碳青霉烯酶耐药基因(NDM、KPC和OXA-48)，反应体系为25 μL，包括6 μL DNA模板和19 μL PCR反应混合液。PCR反应条件为37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，循环1次；93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环35次，单点荧光检测温度为60 ℃。荧光通道检测选择：ydij、KPC基因选用 FAM 通道，NDM、OXA-48 基因选用 ROX 通道，内标基因选用 JOE 通道。(2)基因测序：设计CRE常见碳青霉烯酶耐药基因(NDM、KPC、OXA-48、IMP和VIM)引物进行测序[8]，将CRE菌株测序后所得的序列与GenBank核酸数据库(NDM：JX104760；KPC：1i844849；OXA-48：NC_049454.1；IMP：JX104760；VIM：NG_022326.1)进行BLAST序列比对，见表1。

表1 耐药基因测序引物

1.5CRKP的同源性分析 以CRKP菌株DNA为模板，参考多位点序列分析(MLST)官方网站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella /klebsiella.html)上提供的肺炎克雷伯菌的7个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)序列合成引物，见表2；依次扩增CRKP菌株的这7个管家基因。PCR反应条件如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃，10 min。将CRKP菌株的7个管家基因PCR产物进行双向测序。得到测序结果后分析CRKP菌株的亲缘性关系，即进行同源性分析。

表2 肺炎克雷伯菌的7个管家基因引物序列

2 结 果

2.1菌株分布 在222株CRE中，细菌培养鉴定法检出大肠埃希菌78株(35.1%)，肺炎克雷伯菌71株(32.0%)，阴沟肠杆菌28株(12.6%)，霍氏肠杆菌13株(5.9%)，费氏柠檬酸杆菌9株(4.1%)，植生拉乌尔菌8株(3.6%)，产气肠杆菌6株(2.7%)，产酸克雷伯菌5株(2.3%)，解鸟氨酸拉乌尔菌3株(1.4%)，克氏柠檬酸杆菌1株(0.5%)。将荧光定量PCR鉴定+基因测序鉴定的结果与细菌培养鉴定结果进行对比，细菌培养鉴定为大肠埃希菌的78株中，测序鉴定76株符合细菌培养鉴定结果，另2株分别为产酸克雷伯菌与霍氏肠杆菌。细菌培养鉴定的符合率为97.4%。

2.2药敏试验结果 222株CRE菌株对大部分抗菌药物的耐药率都大于80.0%，对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、米诺环素具有较好的敏感性，见表3。

表3 222株CRE菌株对常用抗菌药物的药敏试验结果

2.3荧光定量PCR与基因测序结果 222株CRE荧光定量PCR与基因测序同时检出NDM基因阳性131株(59.0%)，荧光定量PCR检出KPC基因阳性56株(24.3%)，基因测序检出IMP基因阳性13株(5.9%)，VIM基因阳性仅有1株(0.5%)，OXA-48基因阳性仅1株(0.5%)，荧光定量PCR未检出耐药基因20株(9.0%)，见表4。通过荧光定量PCR检测耐药基因NDM、KPC、OXA-48的检出率为84.7%；通过基因测序检测耐药基因NDM、KPC、OXA-48、IMP、VIM的检出率为91.0%。将NDM、KPC和OXA-48基因的荧光定量PCR结果与基因测序结果进行分析，结果显示NDM荧光定量PCR的阳性符合率为98.5%，阴性符合率为97.8%；KPC基因荧光定量PCR的阳性符合率为94.6%，阴性符合率为99.4%；OXA-48基因荧光定量PCR的阳性符合率为100.0%，阴性符合率为100.0%。

表4 CRE耐药基因荧光定量PCR和耐药基因测序结果(n)

2.4MLST结果 对49株CRKP的MLST结果显示，ST11型最多为26株，其次为ST15型7株，ST2357型4株，ST1810型3株，ST278型2株，ST2388型2株，ST86型1株，ST347型1株，ST697型1株，ST1326型1株，ST2790型1株。

3 讨 论

CRE往往对多种抗菌药物严重耐药，治疗极其困难，已成为全球范围的公共卫生问题[9]。本研究收集的222株CRE，检出株数位居前两位的依次为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，与CHINET的调查结果一致[10]。

NDM型碳青霉烯酶于2009年在印度新德里被发现后迅速播散至全球，亚洲是产NDM型碳青霉烯酶菌株流行的主要区域[11-13]。本研究通过对78株耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CREC)的基因检测发现，大肠埃希菌以NDM基因最多(65株)，耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌也以NDM耐药基因为主，占比达85.7%(24/28)。NDM耐药基因表型的传播机制不同于其他碳青霉烯酶，该基因型多见于我国北方医院[14]。新型含酶抑制剂的复方制剂头孢他啶-阿维巴坦对产金属酶的CRE无效，但却是目前治疗产KPC型和OXA-48型CRE的最好药物[15]，并且该药适用于复杂性尿路感染和院内获得性肺炎[16]，是治疗CRE感染的理想药物。

自2007年浙江省报道CRKP后，相关研究也证实KPC基因是我国肺炎克雷伯菌携带的最常见的碳青霉烯酶耐药基因[17]。本研究通过对71株肺炎克雷伯菌的基因检测发现，肺炎克雷伯菌以KPC耐药基因最多(49株)，与前文报道一致。

OXA-48耐药基因最早发现于2001年的土耳其，很快引起医院内暴发流行，有研究表明OXA-48基因比KPC、NDM基因更易于在肠杆菌科细菌中播散[18]，主要在儿童患者中分离[19]。产VIM酶的CRKP最早于2001-2003年在南欧被发现，本研究发现1株携带VIM基因的肺炎克雷伯菌。

本研究49株CRKP的MLST结果显示ST11型为主要的流行克隆株，占53.1%，这与ST11型CRKP为我国流行克隆株的报道一致[20]。

CRE引起的院内感染导致了病死率升高与医疗成本的明显增加，鉴于目前CRE的治疗难度，采取有效措施防止耐药菌的蔓延为当务之急。对于此类耐药细菌所致感染或定植的防控应多管齐下，有效感染防控措施包括手卫生、加强监测、接触预防、患者隔离(单间隔离或集中隔离)和环境清洁等。