应用GSP筛查新生儿G6PDd的性能验证及cut-off值设定*

魏庆玲，梁 睿，李冬秀，陈伟荣，吴学威，黄 湘，3△

1.南方医科大学第二临床医学院，广东广州 510000；2.中山市博爱医院产前诊断中心，广东中山 528400；3.南方医科大学附属佛山妇幼保健院产前诊断中心，广东佛山 528000

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PDd)是由于基因缺陷而引起红细胞膜表面葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)降低，使得维持红细胞膜稳定性的还原型谷胱甘肽生成减少而不能抵抗氧化损伤而造成的疾病。新生儿G6PDd主要临床表现为急性溶血、遗传性非球形细胞性溶血性贫血、高胆红素血症，因新生儿血脑屏障尚未完全建立，易引起核黄疸导致人体脑部损伤等[1-3]。全自动荧光免疫分析仪(GSP)操作便捷，检测结果的准确性较高[4]，中山市博爱医院(以下简称本院)2017年引进GSP，本文旨在探讨GSP筛查系统用于新生儿G6PDd筛查的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2018年3-8月中山市分娩的2 742例新生儿为研究对象，为全市23个(市)镇区25家医院分娩的新生儿，均送外周血(足跟血或脐血)标本至中山市博爱医院产前诊断中心(以下简称本中心)进行G6PDd筛查，排除早产儿及低出生体质量儿。

1.2仪器与试剂 主要仪器有芬兰 PerkinElmer(PE)公司生产的GSP(型号2021-0010)，芬兰PE公司生产的半自动荧光免疫分析仪(型号Victor2D1420，半自动荧光免疫分析法)及Panthera-PuncherTM9打孔仪，广州丰华生物工程有限公司生产的微量振荡器(型号FWZ-1)等。试剂盒使用芬兰PE公司生产的GSP Neonatal G6PD试剂盒(全自动荧光免疫分析法)、Neonatal G6PD试剂盒(半自动荧光免疫分析法)。

1.3标本采集 严格按照原卫生部《新生儿疾病筛查技术规范(2010版)》制作滤纸干血片：在新生儿出生48～72 h充分哺乳后采集足跟血，制成滤纸干血片，干血片室温平放晾干后，4 ℃保存，最迟不宜超过5 d送至本中心进行筛查。

1.4方法 试验步骤严格按照GSP Neonatal G6PD试剂盒说明书操作，分析GSP的精密度、正确度、线性范围等，并与厂家声明的参数进行比较。

1.4.1精密度验证 采用试剂盒自带标准品B、D、E 3个浓度标本作为测试标本，每个浓度标本每天测量1个批次，共进行5 d，每批次对各浓度标本重复测量3次，每个浓度各15个测量值，计算批内变异系数(CV批内)、批间变异系数(CV批间)和总变异系数(CV总)。

1.4.2正确度验证 采用试剂盒自带质控品L(指定靶值16.4 U/dL)和H(指定靶值56.1 U/dL)两个浓度标本作为测试标本，每份标本每天测量1个批次，每批次测量5次，共进行5 d，每个浓度各25个测量值，统计测量总均值与靶值的相对偏差是否小于10%(1/3TEa)。

1.4.3线性范围验证 采用试剂盒自带标准品B、C、D、E、F作为测量标本，浓度梯度分别为9.0、18.3、35.5、77.1、120 U/dL。每个标本测量3次，在同一批测量中完成，考察测量均值与理论值的线性关系。

1.4.4质控 每批测试均进行室内质控标本测量，当质控品结果超出规定的失控限时剔除，重新进行试验。

1.4.5cut-off值的设定 严格依据GSP Neonatal G6PD 试剂盒和Neonatal G6PD试剂盒说明书同步检测2 742例新生儿滤纸干血片的血G6PD水平。

1.5统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行数据处理及统计分析。检测值与理论值的关系采用线性回归方程分析。采用Dixon方法检查并剔除离群值，采用百分位数分布及受试者工作特征(ROC)曲线建立cut-off值；两种仪器检测结果一致性检验采用Kappa检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1GSP性能验证

2.1.1精密度验证结果 GSP检测试剂盒自带标准品B、D、E中G6PDCV批内分别为2.09%、1.54%、1.90%，均小于厂家声明的CV批内(3.40%)；CV批间分别为2.45%、1.03%、1.26%；CV总分别为3.08%、1.72%、2.12%，小于厂家声明的最低CV总(3.90%)。

2.1.2正确度验证结果 质控浓度为L的25份标本的测量总均值与靶值的相对偏差为3.84%，质控浓度为H的25份标本的测量总均值与靶值的相对偏差为3.44%，均小于10%，试剂盒检测G6PD正确度符合要求。

2.1.3线性范围验证结果 B、C、D、E、F 5个浓度的试剂盒自带标准品标本的检测值和理论值的线性回归方程为Y=1.008 2X+0.012 5，决定系数(R2)为0.999 1，线性相关性良好见图1。

图1 GSP检测G6PD检测值和理论值线性关系

2.2GSP检测结果

2.2.1GSP检测结果的百分位数分布 2 742例新生儿的血G6PD水平P1、P5分别为4.27、20.10 U/dL。以P1为cut-off值时，2 742例新生儿中27例筛查阳性(筛查阳性率为0.985%)，其中女2例，男25例；以P5为cut-off值时，2 742例新生儿中135例筛查阳性(筛查阳性率为4.923%)，其中女48例，男87例。

2.2.2ROC曲线分析 G6PD诊断G6PDd的曲线下面积(AUC)为0.963。ROC 曲线以约登指数(灵敏度+特异度-1)最大值为最佳诊断值，即cut-off值为22.40 U/dL时灵敏度及特异度最高。以22.40 U/dL为cut-off值时，2 742例新生儿中175例筛查阳性(筛查阳性率为6.382%)，其中女74例，男101例。见图2、表1。

图2 采用G6PD筛查G6PDd的ROC曲线

表1 不同G6PD水平诊断G6PDd的灵敏度和特异度

续表1 不同G6PD水平诊断G6PDd的灵敏度和特异度

2.2.3两种仪器检测结果比较 GSP和半自动荧光免疫分析仪对2 742例新生儿滤纸干血片同步进行检测，结果显示半自动荧光免疫分析仪筛查阳性90例，阴性2 652例，GSP筛查阳性135例，阴性2 607例，两种仪器检测结果具有一致性(Kappa=0.783,P<0.001)。以半自动荧光免疫分析仪为标准，GSP的灵敏度、特异度、阳性符合率分别为65.92%、99.96%、98.29%。见表2。

表2 两种仪器检测结果比较(n)

3 讨 论

G6PD的检测方法包括荧光斑点定性试验、速率法、荧光分析法、G6PD/6PGD比值法等[5-9]。 GSP操作更便捷，能够减少实验技术人员的手工操作时间，特别适合开展大规模的新生儿疾病筛查。本院按照临床定量实验性能验证方案对GSP检测G6PD的精密度、正确度和线性范围进行了评估，并初步确定cut-off值[10-11]。

实验检测结果准确和稳定是遗传代谢病诊断的最基本前提。正确度的验证结果表明GSP配套的G6PD检测试剂盒自带的高、低两个浓度的质控品和靶值的相对偏差小于10%(1/3TEa)，说明GSP检测G6PD的正确度通过验证。从精密度的验证结果看，应用GSP对试剂盒自带两个浓度质控品检测的CV批内分别为2.09%、1.54%和1.90%，CV总分别为3.08%、1.72%和2.12%，均小于厂家声明的3.40%和3.90%，说明GSP新生儿筛查系统检测G6PD的精密度符合要求；线性范围的验证结果显示测定项目理论值与测定均值的R2为0.999 1，GSP检测G6PD的检测值和理论值具有非常高的线性相关性，线性范围内符合要求，总之GSP的精密度、正确度、线性范围与厂商声明的分析性能基本一致，能够满足临床检测要求。通过对2018年3-8月2 742例新生儿GSP检测结果分析，对比百分位数分布和ROC曲线分析设立的cut-off值，ROC曲线筛查的阳性率更高，相应的假阳性率也会升高，因此其更适合于标本量大的数据，故新生儿G6PD cut-off值以G6PD水平P5为标准[12-13]。2 742例新生儿干血片标本在GSP上测得的G6PD水平P5为20.10 U/dL。以P5(20.10 U/dL)为cut-off值，初筛阳性率为4.923%，其中48例女性，87例男性。2008年陈亚军等[14]报道韶关市71 892例新生儿G6PDd初筛阳性率为5.19%(3 729/71 892)；2013年郭小玲等[15]报道中山市25 021例新生儿G6PDd筛查阳性率为3.63%(908/25 021)，其中男性阳性率为5.40%，女性阳性率为1.40%；2016年张延玮等[16]报道汕头市104 079例新生儿G6PDd初筛阳性率为1.60%；2017年刘冬霞等[17]报道清远市57 815例新生儿G6PDd初筛阳性阳性率为6.17%(3 568/ 57 815)；2018年唐芳等[18]报道广州市16 319例新生儿中，G6PDd筛查阳性率为4.21%(687/16 319)，其中男6.40%，女1.70%；2019年杨应松等[19]报道江门市73 813例新生儿总体筛查阳性率为4.14%(3 027/73 183)，男女筛查阳性率分别为 6.88%(2 632/38 240)、1.13%(395/34 943)，总体筛查阳性率接近本研究中采用P5为cut-off值时的筛查阳性率。另外，以半自动荧光免疫分析仪筛查结果为标准，cut-off值为21.00 U/dL时，计算得出GSP检测结果的特异度、阳性符合率均较高，若以ROC曲线计算出的22.40 U/dL为cut-off值，将召回更多的患儿，提高假阳性率。本研究通过百分位数分布计算得出的新生儿G6PD筛查cut-off值仅作为项目开展初期实验室的初始cut-off值。

综上所述，GSP用于中山市新生儿筛查G6PD检测性能和厂家声明的一致，检测系统具有良好的精密度、准确度、线性范围，对比GSP与半自动荧光免疫分析仪一致性较好，说明将GSP筛查系统应用于新生儿G6PD的检测是可行的。通过本研究还确定了GSP检测新生儿G6PD的cut-off值，明确了参考值对G6PDd的诊断、治疗和预后判断有重要指导意义。本中心将定期回顾性分析总结，增大标本量后可重新设定cut-off值，并根据不同的胎龄和体质量进一步校正筛查cut-off值，以提高筛查工作质量和筛查效率。