含葡萄籽或紫色象草饲粮体外发酵特征的差异

2022-08-06强艳沈振峰冉航文明星屈红君顾玉明胡莉芸李明明刘婷

中国饲料 2022年9期

强艳，沈振峰，冉航，文明星，屈红君，顾玉明，胡莉芸，李明明，刘婷

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

花青素广泛的存在于被子植物中，是由植物体内丙酮途径生物合成的水溶性多酚类物质，具有良好的抗氧化、改善机体健康、促进畜禽生长的功能（Zhao等，2018；Mossalayi等，2014）。前期研究发现，花青素能够维持瘤胃内环境平衡，调控瘤胃发酵功能和微生物区系结构（Tian等，2021；Tian等，2019；Spanghero等，2009）。葡萄籽中花青素含量较高，反刍动物饲料中添加葡萄籽可以改善肉品质，增加平均日增重，提高瘤胃pH，调控瘤胃内琥珀酸弧菌属和普雷沃氏菌属细菌相对丰度（Sharifi等，2018；Correddu等，2015；Jeronimo等，2012）。象草（Pennisetum purpureum Schum.）为多年生禾本科暖季型牧草，具有产量高、鲜嫩多汁和适口性好等特点，成为我国南方地区主要的栽培型牧草。其中，紫色象草中花青素含量为26.60 mg/100 g，是其他象草品种原花青素含量的3 倍以上（邓素媛等，2021）。但目前鲜有报道关于紫色象草原花青素对瘤胃发酵功能和甲烷产量影响的研究。基于此，本试验旨在比较相同营养水平下，添加同一水平葡萄籽、紫色象草、葡萄籽和紫色象草混合对体外瘤胃甲烷产量、营养物质降解率和瘤胃发酵参数的影响，为开发紫色象草和葡萄籽作为绵羊功能性饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 瘤胃液供体动物和饲料配方本试验选择3只体况良好、体重相似[（36.01± 0.37）kg]的4 月龄大尾寒羊作为瘤胃液供体动物。参照NRC（2007）配制试验羊全混合日粮（表1）。试验羊分别在每天07：30、12：30 和18：30 饲喂3次，自由采食和饮水。每天对羊舍进行清理，定期进行消毒和驱虫。

表1 试验羊全混合饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.2 试验设计试验采用单因子完全随机设计，分为3 个处理组，分别为葡萄籽组（GS 组）、紫色象草组（EG 组）、葡萄籽和紫色象草混合组（GS ×EG 组）。参照NRC（2007）配制等营养水平的全混合饲粮（表2），粉碎过40 mm 筛后作为体外瘤胃发酵的底物。

表2 全混合饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 体外发酵试验按照Menkede 等（1979）试验方法配制人工瘤胃缓冲液。试验羊晨饲前，利用口腔采集器采集3 只供体动物瘤胃液，经4 层无菌纱布过滤至39 ℃恒温并持续注入CO2厌氧的保温桶内，迅速带回实验室。称取各处理组饲料（0.2000±0.0020）g 装入150 mL 的厌氧发酵罐，置于39.5 ℃的恒温培养箱内预热3 h后，在每个发酵罐中加入60 mL 瘤胃人工培养液（体积比=1：2）。参照Wang 等（2016）方法进行48 h 体外发酵试验，试验期间向发酵罐内不断通入CO2，保持试验环境在厌氧且恒温（39.5 ℃）的条件下进行。每个样品每个时间点设置2 个平行，每个平行3个重复，同一批次3 个空白对照。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 产气量及甲烷产量分别在体外培养3、9、12、24 h 和48 h 时记录每个发酵罐连接注射器活塞处的刻度，参照代秦丹等（2021）公式计算各时间点产气量（GP）。公式如下：

式中：t 为时间点的累计产气量，mL/g；Vt为t h体外发酵后样品注射器活塞处的刻度；V0为t h体外发酵后空白注射器活塞处的刻度；W0为样品干物质重量，g。

参照Menke 等（1988）研究建立的指数模型对不同处理相应的GP 进行非线性回归拟合，计算相应指数。公式如下：

式中：GPt为t 时间点的累计产气量，mL/g；B 为最大理论产气量，mL/g；c 为体外产气速度，%/h；t 为体外发酵时间，h；lag 为体外产气滞流时间，h。

每个时间点利用集气袋采集注射器内的气体样品，利用气相色谱仪（6890N，Agilent，美国）测定甲烷产量，分析测定参考张然等（2018）的方法。公式如下：

式中：CH4产气量，mL/g；GPt为t 时间点的累计产气量，mL/g；W 为总产气量中CH4百分比，%。

1.4.2 不同处理饲料中营养成分的测定参照AOAC（2006）的方法测定不同处理饲料中干物质（DM），粗蛋白质（CP）和粗灰分（Ash），中性洗涤纤维（NDF）参考Van Soest 等（1991）的方法测定。

1.4.3 体外发酵参数的测定每个时间点对应的发酵罐结束发酵后，使用便携式酸度计（PHS-3C，上海雷磁，中国）测定发酵液pH。通过4 层无菌纱布过滤至于10 mL 冻存管保存于-20 ℃冰箱用于测定培养液中的氨态氮（NH3-N）和挥发性脂肪酸（VFA）浓度，其中，发酵液中NH3-N 浓度利用比色法测定（Broderick 和Kang，1980）；VFA 利用气相色谱仪（6890N，Agilent，美国）参考Wang 等（2016）的方法分析测定。

1.4.4 发酵底物营养成分体外降解率的测定

1.5 数据统计与分析使用Excel 365 对数据进行整理和初步统计后，利用SPSS 23.0 软件包中的one–way ANOVA 进行分析，差异显著时，采用Tukey 法进行多重比较。P <0.05 表示差异显著，P ≥0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 比较饲粮中添加葡萄籽和紫色象草体外发酵产气性能和甲烷产量的差异各处理GP 随着体外发酵时间的推移增加，3～9 h 的GP 增加速度最快（表3）。EG 组体外发酵9 h 时GP 显著高于GS × EG 组（P=0.026），发酵12 h 时GP 显著高于其他两个处理组（P=0.044）。体外发酵24 h和48 h EG 组GP、理论最大产气量和体外产气滞流时间均显著高于GS 组（P=0.031，P=0.019，P=0.038，P=0.045）。由表4 可知，各时间点EG 组甲烷产量均显著高于其他处理组（P=0.007，P=0.004，P=0.024，P=0.013，P=0.039）。

表3 不同处理各时间点GP以及48 h 产气动力学参数

表4 不同处理各时间点甲烷产量 mL/g

2.2 比较饲粮中添加葡萄籽和紫色象草48 h 体外发酵参数的差异由表5 可知，体外发酵48 h后，EG 组发酵液pH 为5.88，显著低于其他两个处理组（P=0.023），NH3-N 浓度为19.40 mg/100 mL，显著低于GS 组（P=0.016）。而EG 组发酵液总挥发性脂肪酸（TVFA）含量为230.41 mmol/L，显著高于其他两个处理组（P <0.001），乙酸摩尔比显著高于GS 组（P=0.021）。

表5 不同处理48 h 体外发酵参数

2.3 比较饲粮中添加葡萄籽和紫色象草48 h 体外发酵底物降解率的差异由表6 可知，体外发酵48 h 结束后，EG 组发酵底物体外干物质降解率（IVDMD）达到62.08%，显著高于其他各处理组（P <0.001），体外有机物降解率（IVOMD）达到54.43%，显著高于GS 组（P=0.034）。

表6 不同处理体外营养物质降解率 %

3 讨论

3.1 饲粮中添加葡萄籽和紫色象草体外发酵产气性能和甲烷产量的差异饲粮中碳水化合物和蛋白质经过瘤胃微生物降解后生成最终产物VFA，在此过程中产生大量的气体，包括CO2、CH4和H2等。体外发酵产气量是反映瘤胃对饲粮的降解程度和瘤胃微生物活性的关键指标，且与发酵底物降解率、微生物活性呈正相关关系（Amanullah等，2021；Hassan等，2020；Wang等，2019；Khattab等，2018）。本试验中EG 组体外发酵产气量显著高于GS组，相对于葡萄籽，紫色象草含有较多的可降解碳水化合物，瘤胃微生物对含有紫色象草的饲料更容易降解。研究表明，饲粮中纤维素和蛋白质含量等不易降解成分与体外产气量呈负相关；非结构型碳水化合物含量较高的饲粮在体外发酵24 h 以内便可达到GP 峰值，而结构型含量较高饲粮的GP 峰值则出现在体外发酵48 h 之后（Rocha，1992）。本试验3 个处理组GP 峰值均出现在24 h，由此可以推断葡萄籽和紫色象草中均含有较多的非结构型碳水化合物，易被微生物快速利用进行降解。前期研究证实，产气动力学参数是衡量反刍动物瘤胃对饲粮碳水化合物降解的重要指标（López等，2007；Andrés等，2005）。本试验中EG 组理论最大产气量和体外产气滞流时间显著高于GS 组。Schofield 等（1994）研究中发现瘤胃体外发酵理论最大产气量与IVNDFD呈正相关。由此可知紫色象草与葡萄籽相比，含有更多的有效中性洗涤纤维，在瘤胃内容易被微生物降解。体外产气滞流时间能够反映瘤胃对于饲料中碳水化合物利用的难易程度，体外产气滞流时间越短，饲料碳水化合物被瘤胃微生物降解的速度越快，且与饲料干物质降解率呈正相关（Wan等，2021；Ma等，2020；He等，2019）。综上所述，相比葡萄籽，紫色象草含有更多的非结构型碳水化合物，其中的结构型碳水化合物更有利于被瘤胃微生物降解和利用。

反刍动物瘤胃微生物发酵产生的甲烷是引起饲料能量损失的重要因素，占饲粮总能量的2%～12%（Johnson，1995）。本试验结果表明，EG 组各个时间点甲烷产量显著高于GS 组。相较于葡萄籽，紫色象草中含有瘤胃微生物更易利用的碳水化合物，发酵产物甲酸通过脱氢酶的作用下生成H2和CO2，其中CO2还原为甲烷；另外甲酸也是产甲烷菌合成甲烷的重要底物，进一步提高了甲烷产量。此外，葡萄籽中单宁的含量丰富。Parthasarathi 等（2018）在添加单宁饲料的48 h 体外发酵试验中发现，添加单宁可增加IVDMD，减少甲烷产量。本试验也得到相似的试验结果，GS 组和GS × EG组因葡萄籽中单宁有效的抑制了甲烷产量。反刍动物饲粮中添加含有单宁的饲料能够有效降低甲烷的排放量，其原因是单宁能够抑制瘤胃产甲烷菌和原虫（Pathak等，2017；Bento等，2007）。

3.2 饲粮中添加葡萄籽和紫色象草48 h 体外发酵参数的差异瘤胃pH 是评价瘤胃内环境和发酵模式的最重要指标之一。正常瘤胃内pH 为5.50～7.00，且与TVFA 浓度呈负相关关系（Carro等，2009；Le Ruyet等，1992），本试验结果与其相似。谢华德等（2021）和彭婉婉等（2020）利用含有紫色象草和葡萄籽的饲粮作为底物的体外发酵试验中也得到了相同的试验结果。综上所述，含有紫色象草和葡萄籽的饲粮体外发酵期间不会影响瘤胃微生物的增殖和功能。Abarghuei 等（2015）研究表明，在饲粮中添加葡萄渣可显著升高瘤胃pH。这也可能是造成本试验结果中含有葡萄籽饲粮发酵液pH 高于含有紫色象草饲粮的原因。

瘤胃VFA 是瘤胃微生物发酵饲粮的最终产物，其中乙酸、丙酸和丁酸的比例占TVFA 含量的95%以上；是反刍动物主要的能量来源，也是瘤胃微生物增殖主要的碳架来源（Wang等，2020；Gray等，1951）。VFA 浓度是衡量饲粮碳水化合物发酵水平和模式的重要指标。本试验中，EG 组TVFA显著高于其他两个处理组，虽然3 个处理组在同一营养水平，但是紫色象草比葡萄籽更容易被瘤胃微生物降解。饲粮组成、水平和来源都是影响VFA 比例和组成的因素（Noziere等，2011；Lane等，2000）。本试验中，EG 组乙酸摩尔比显著高于GS 组。发酵底物中纤维素和半纤维素等结构型碳水化合物发酵产生较多比例的乙酸，而易发酵的淀粉等非结构型碳水化合物发酵后则会产生较高比例的丙酸（Noziere等，2011）。由此可以推断，紫色象草中含有更多容易被瘤胃微生物降解的结构型碳水化合物。另外乙酸/丙酸是反映瘤胃发酵类型的重要指标，也能从侧面反映瘤胃微生物菌群结构，受供体动物品种和饲粮结构的影响，其值基本在2.0～3.0（张霞等，2019）。本试验结果在此范围内，虽然EG 组饲粮在瘤胃内有较高的降解率，但本试验3 个处理组饲粮在同一水平。由此推断，饲粮营养水平是影响瘤胃乙酸/丙酸主要因素。

瘤胃NH3-N 即是瘤胃微生物分解底物中含氮物质的最终产物，也是合成菌体蛋白的主要氮来源。瘤胃NH3-N 浓度在最佳范围6.58～36.70 mg/100 mL 时适宜瘤胃微生物的增殖（Chen等，2007）。本试验3 个处理组瘤胃NH3-N 浓度均在这一区间内，表明体外发酵48 h 内发酵液中微生物菌群处于一个适于生长和增值的环境内。此外，EG 组瘤胃NH3-N 浓度显著低于GS 组。研究证实，碳水化合物结构和浓度是限制瘤胃微生物利用瘤胃内NH3-N 的主要因素。本试验中EG 组有较高的产气量和TVFA 浓度，由此可以推测，EG组48 h 发酵后瘤胃NH3-N 浓度最低的原因是被瘤胃微生物利用作为合成微生物蛋白原料。此外，da Silva 等（2021）研究发现，奶山羊饲料中添加单宁提高了瘤胃内NH3-N 浓度，这可能是因为单宁减少了微生物对于饲料蛋白的利用率，从而增加了过瘤胃蛋白的含量。这也是造成本试验结果的另一个因素。

3.3 饲粮中添加葡萄籽和紫色象草48 h 体外发酵底物降解率的差异饲料降解率是反映饲料碳水化合物被反刍动物降解和利用的一个重要指标，饲料可消化营养物质越多其营养价值越高。本试验中EG 组IVDMD 和IVOMD 显著高于GS组。许兰娇等（2019）研究发现，苎麻和象草混合青贮饲料的IVDMD 随着象草比例的增加而升高，这可能是因为象草的木质化程度较低，瘤胃微生物能够降解的结构型碳水化合物含量高引起的。张力莉等（2017）和彭婉婉等（2020）的研究均发现，添加葡萄籽可降低饲粮IVDMD。这可能是因为葡萄籽中结构型碳水化合物含量较高，降低了瘤胃微生物对其的降解和利用。结合瘤胃发酵参数结果，进一步证实紫色象草比葡萄籽拥有更高的营养价值。