一株喜油嗜热芽孢杆菌G1201 产高温蛋白酶的性质研究及异源表达初探

朱 檬，刘国瑞 ，张军 ，汤伟，2，孙晓雯，唐涛，2，赵丽红，何增国

（1.中国海洋大学医药学院，山东青岛 266000；2.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛 266000；3.青岛百奥安泰生物科技有限公司，山东青岛 266000）

蛋白酶是一种重要的酶制剂，在饲料、食品、医药等领域有着广泛的应用（Goutam 和Arun，2017）。有统计显示，在酶制剂市场份额中蛋白酶占比超过65%（Garg等，2016）。随着人们对产品品质追求的提高和生产分工的细化，普通蛋白酶逐渐无法满足如饲料制粒、食品烘焙中的高温过程，这些行业对高温蛋白酶提出了迫切需求。

微生物以其来源广泛、培养周期短、便于工程化操作成为目前蛋白酶最主要的来源（于建荣等，2015；邓菊云，2008；张燕新等，2007）。更重要的是许多极端自然环境中，如火山口、海底热液区、热泉等天然存在许多耐热的微生物菌种，其中必然孕育了高温蛋白酶的基因资源。对其中微生物种质资源的发掘，可为高温蛋白酶的开发提供筛选基础。已有研究报道，从这些环境中筛选得到了具有良好应用前景的高温蛋白酶（桑鹏等，2019；桑鹏等，2019；陈逍遥，2015；Mashayekhi等，2012）。

目前已报道产高温蛋白酶的菌属有芽孢杆菌属、热球菌属、硫化叶菌、火球菌属等（曾静，2014；吕明生等，2011；闻真珍，2010；黄光荣等，2007）。Geobacillus 属是2001 年被命名的一个耐热菌属，该属微生物来源广泛，具有良好的耐热性（Nazina等，2001）。已有一些从该属微生物中分离得到高温蛋白酶的报道（Goutam 和Arun，2017；廖艳江，2010；Chen等，2004；Nazina，2001）。本文从长期处于高温的烧烤环境中分离得到1 株喜油嗜热芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans），发现其产高温蛋白酶的功能，并对其产高温蛋白酶进行了表征和酶学性质研究。同时，本文通过基因工程菌手段，尝试对该高温蛋白酶进行异源表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 T4 DNA Ligase、胶回收试剂盒、IPTG 和硫酸卡那霉素购自上海生工生物工程有限公司；限制性内切酶（EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ）购自大连宝生物有限公司；基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；酪氨酸、福林酚购自Sigma；其余非特殊注明试剂均购自国药化学试剂有限公司。

菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）和质粒pET-28a（+）由中国海洋大学海洋生命学院惠赠。

1.1.2 培养基及缓冲溶液、试剂 脱脂奶粉筛选培养基参照Thebti（2016）方法并做出改良：脱脂奶粉20 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 L，115 ℃，灭菌20 min。

酪蛋白标准溶液：称取0.500 g 酪蛋白，用少量0.5 moL 的NaOH 溶液润湿，然后加入缓冲液大约40 mL，沸水浴30 min，期间搅拌至完全溶解，冷却后定容至50 mL。

1.1.3 样品来源 土壤样品采集自中国海洋大学浮山校区附近（36.075422°N，120.437054°E）蒸汽排气口下含油土样。

1.2 方法

1.2.1 产高温蛋白酶菌株筛选及理化特征鉴定取采集土样25 g 加入到225 mL 无菌水中，180 r/min摇培30 min，制成样品悬液。取1 mL 样品悬液加入到9 mL 无菌水中进行10 倍梯度稀释。选取合适的稀释梯度，取100 μL 涂布于脱脂奶粉培养基上，65 ℃培养24 h。观察比较水解圈直径与菌落直径比值，选取比值最大的进行液体复筛，70 ℃下测量发酵液酶活，筛选出酶活最高的菌株，编号G1201。对筛选得到的菌株在LB 固体培养基上进行连续3 次划线分纯，甘油管保藏纯化出的单菌落以待进一步研究。

参照《常见细菌系统鉴定手册》对G1201 进行厌氧性、运行性、触酶等生理性质鉴定，并利用O’Meara 法进行V-P 实验鉴定其生化特征。同时，进行革兰氏染色，并用透射电镜（TEM）观察G1201 的菌体形态特征。

1.2.2 16S rRNA 基因序列分析及系统发育构建采用基因组提取试剂盒提取G1201 基因组DNA。以此为模板，采用通用引物 27 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492 R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩 增G1201 的16S rRNA 基因序列。PCR 反应条件（张军，2110），95 ℃55 min；94 ℃0.5 min，55～ 60 ℃0.5 min，72 ℃1 min，35 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物送上海生工测序。测序结果在GeneBank 中进行Blast N 比对，用MEGA7.0 软件，采用Neighbor-Joining 法构建系统发育树，进化树分支采用Bootstrap 法并重复1000 次。

1.2.3 粗酶的制备及酶活测定 将G1201 菌株接入LB 培养基中，65 ℃，180 r/min 培养16 h，离心取上清液。在4 ℃条件下，分别用30%、40%、50%、60%、70%和80%硫酸铵对发酵上清液逐级沉淀过夜。之后，4 ℃，10000 r/min 离心30 min，收集沉淀物，将沉淀分别溶于相同体积的PBS（pH 7.5）中测定酶活，以酶活最大的硫酸铵沉淀物为粗酶，进行酶学性质分析。

酶活力单位定义为：在70 ℃条件下，每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸，定义为一个酶活力单位，以U/mL 表示。酪氨酸标准曲线绘制及酶活测定参照国标GB/T23527-2009（中国国家标准化管理委员会，2009），酶反应温度设为70 ℃。

1.2.4 粗酶的酶学性质分析 粗酶溶于PBS中，进行最适催化温度和温度耐受性测定。将粗酶液与酪蛋白溶液在30～ 100 ℃条件下反应后，于碱性环境中与福林酚溶液进行显色反应，在680 nm处测量其吸光度，确定最适酶催化温度。温度耐受性测定时，将粗酶液放置30～ 100 ℃下水浴孵育1 h后，在最适温度70 ℃下与酪蛋白反应，测定不同温度处理后，对酶活的影响。

粗酶和酪蛋白分别溶于不同pH（pH 4.0～12.0）的缓冲液中，制成粗酶液和酪蛋白标准溶液，在70 ℃下反应，通过测定不同pH 条件下粗酶液与酪蛋白反应的酶活，确定最适催化pH。pH耐受性测定，将不同pH 缓冲液溶解的粗酶液水浴孵育1 h，在70 ℃，pH 9.0 条件下测定酶活，确定其pH 耐受性。

粗酶溶于pH 9.0 的缓冲液，分别加入终浓度5 mmol/L 的Ca2+、Mg2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+和Na+，水浴孵育1 h，在70 ℃，pH 9.0 条件下测定酶活，探究不同金属离子对酶活的影响。

在上述粗酶液中分别添加1%的表面活性剂（SDS、吐温20、吐温80 和曲拉通X-100）和终浓度5 mmol/L 的蛋白酶抑制剂[DTNB（2-硝基苯甲酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）和EDTA（乙二胺四乙酸）。水浴孵育1 h后，在70 ℃，pH 9.0 条件下测定酶活，分析表面活性剂和蛋白酶抑制剂对酶活的影响。

1.2.5 高温蛋白酶的异源表达及分离纯化

1.2.5.1 G1201 蛋白基因克隆与表达载体构建以NCBI 数据库中Geobacillus 属微生物编码丝氨酸蛋白酶基因（ser）的序列为基础，使用DNAMAN软件进行多重序列比对，用Primer 5 软件在ser 基因保守区设计上下游引物FE（5'-CGGAATTCATGTTTGGC TATTCAATAGTGCAGTTAGCCC-3'）和RX（5'-CGCTCGAGCTAGCGCTGCAGCAGTTGCT CAAT-3'），下划线分别为EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点。以G1201 的基因组DNA 为模板，扩增ser 的基因序列，之后分别用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho Ⅰ对扩增片段和质粒载体pET-28a 双酶切。T4 连接酶连接过夜后，热激转化大肠杆菌BL21（DE3）中，用含有硫酸卡纳霉素（终浓度50 μg/mL）的平板、菌落PCR 和质粒单双酶切筛选阳性转化子并送上海生工测序。

1.2.5.2 重组蛋白诱导表达及分离纯化 挑取BL21-pET-28a-ser 单菌落于含50 μg/mL 硫酸卡那霉素的LB 培养基中，37 ℃，180 r/min 培养3 h，至OD600到0.4～ 0.6。之后，加入IPTG（终浓度0.4 mmol/L）诱导表达4 h。4 ℃，8000 r/min 离心10 min 收集菌体，用PBS 洗涤2 次。离心后，加破碎缓冲液重新悬浮菌体进行超声破壁（功率750 W）。超声破碎后离心，分别取上清液和沉淀，进行SDS-PAGE 检测，发现目的条带以包涵体的形式存在于沉淀中。用8 mol/L 尿素溶解包涵体蛋白，低温搅拌洗涤30 min。4 ℃，12000 r/min 离心20 min，取上清过Ni 柱纯化目的蛋白并用蛋白测试试剂盒测定纯化蛋白酶的含量。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

2.1.1 产高温蛋白酶菌株筛选结果 通过在脱脂奶粉筛选培养基上对样品初筛，在65 ℃培养条件下得到14 株产生透明圈的菌株，挑选透明圈直径和菌落直径比值最大的菌株（图1a），进行液体复筛，筛选出酶活最高的菌株，编号G1201。在LB平板上70 ℃下培养24 h后，G1201 菌落直径约3～ 4 mm，呈微黄色、半透明、边缘不规则。该菌株革兰氏染色呈阴性，通过透射电镜观察，该菌株呈杆状，长3.0～ 3.5 μm，宽0.8～ 1.2 μm，端生孢子，有鞭毛（图1b）。

图1 菌株G1201 水解圈（a）和菌株G1201 电镜图（b）

通过厌氧性、运行性、触酶试验等生理生化性质鉴定，G1201 菌株的理化性质如表1 所示。参照《BERGEY’S MANUAL of Systematic Bacteriology Second Edition》（Paul等，2009）所述，确定该菌株与G.thermoleovorans 的理化性质一致。

表1 G1201 的生理生化特征

2.1.2 16S rRNA 基因序列鉴定 通过对G1201的16S rRNA 基因序列扩增后测序，其16S rDNA序列长度为1449 bp，将测得的序列上传至Gen-Bank 数据库（登录号MK208514.1），对16S rRNA基因序列构建系统发育树，结果显示该菌株与G.thermoleovorans 的相似性为99%（图2）。结合电镜观察及生理生化试验，确定该菌株为G.thermoleovorans。

图2 菌株G1201 和相似菌株的系统发育进化树

2.2 粗酶的制备及粗酶学性质的研究

2.2.1 粗酶的制备 参照GB/T23527-2009 建立的酪氨酸标准曲线为Y=0.0099X+0.0111，其R2值为0.9998。以该标曲计算不同硫酸铵沉淀后的酶活，沉淀经PBS（pH 7.5）复溶后，通过福林酚法测定其不同浓度的硫酸铵沉淀物的酶活，发现60%硫酸铵沉淀物复溶后酶活最高。因此以60%硫酸铵下的沉淀物作为粗酶。

2.2.2 粗酶酶学性质 通过测定不同温度下粗酶液的酶活，确定最适催化温度为70 ℃，酶活达16.82 U/mL（图3a）。温度耐受性结果显示，以70℃下测定的酶活为100%，30～ 60 ℃时酶活不变，80 ℃以上酶活有所降低，至100 ℃酶活仍能保持在50%以上（图3b）。

图3 温度对酶活力和稳定性的影响

通过测定不同pH 条件下粗酶液的酶活，确定其最适pH 为9.0（图4a）。pH 耐受性结果显示，以pH 9.0 下测定的酶活为100%，该蛋白酶在碱性环境中耐受性很好，pH 8.0～ 12.0 下的酶活均能达到90%以上，在酸性环境中该酶的的耐受性较差，pH 4.0～7.0下，酶活只有26%～50%（图4b）。

图4 pH 对酶活力和稳定性的影响

粗酶液在含有不同金属离子中孵育1 h后，以没有添加金属离子孵育的酶活视为100%，结果显示Ca2+和Mg2+对酶活具有促进作用，其酶活分别达到131%和117%，Mn2+对酶活基本没有影响，其他离子Co2+、Na+、Fe2+、Zn2+和Cu2+均对酶活力表现出有一定的抑制作用，抑制程度根据其蛋白酶残余酶活判断分别为46%、73%、75%、78%和93%（图5a）。粗酶液在含有不同有机溶剂中孵育1 h 后测酶活，以没有添加有机溶剂孵育的酶活视为100%，结果显示吐温20 和Triton X-100能够促进酶活，其酶活分别达131%和115%，吐温80 对酶活没有影响，而SDS 表现出一定的抑制作用（图6b）。而蛋白酶抑制剂DTNB、PMSF 和EDTA 表现出对酶活较强的抑制作用，其残余酶活分别为5%、60%、28%（图5b）。

图5 金属离子及表面活性剂和抑制剂对酶活力和稳定性的影响

2.1.5 G1201 蛋白基因的克隆与表达载体的构建通过对克隆基因PCR 产物测序，其基因长度为1434 bp，将核酸序列上传至国家微生物科学数据中心（NMDC），基因编号：NMDCN0000Q22。在MDAMAN 软件中翻译该基因序列，得到其编码蛋白酶序列（图6）。在Genebank 数据库对克隆基因序列和翻译后的蛋白序列进行Blast，结果显示其为编码ser 蛋白酶的基因，属于属于丝氨酸蛋白酶家族，且存在该蛋白酶家族保守的氨基酸基序GTSMATP。在ExPasy 网站中用ProtParam tool，分析其序列特征，结果预测显示该蛋白稳定指数小于40为稳定蛋白，总平均亲水性为负值表明该蛋白为亲水性蛋白（表2）。将克隆的目的基因连接到质粒载体pET-28a上，通过双酶切验证（图7），成功构建了目的基因的重组质粒载体pET-28a（+）-ser。

图6 核酸序列和编码蛋白序列

表2 蛋白理化性质预测

图7 重组质粒酶切

2.3.2 重组蛋白的表达及鉴定 提取重组质粒载体pET-28a（+）-ser 转入表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）中，构建表达该蛋白酶的基因工程菌BL21（DE3）-pET-28a（+）-ser。以IPTG 为诱导物诱导目的基因表达，结果显示在诱导4 h 的发酵液中约50 kD 处出现了目的条带（图8）。

图8 蛋白酶诱导表达电泳图

2.3.3 重组蛋白酶的纯化 菌体破壁后电泳结果显示，目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中，用8 mol/L 尿素对包涵体进行复性。之后，通过Ni 柱进行纯化，得到了目的蛋白（图9）。通过BCA 法测得的纯化后蛋白质浓度为0.108 mg/mL。

图9 目的蛋白的纯化电泳图

3 讨论

耐高温蛋白酶可适应高温加工环境，在饲料制粒、食品烘焙、高温洗涤等行业有重要的应用，一直以来都是研究的热点（Manavalan等，2020；Niu等，2017；Dadshahi等，2016；Charbonneau等，2012）。Geobacillus属的微生物作为2001年从Bacillus属分离出的嗜热菌群，其中蕴含了丰富的耐高温蛋白酶资源。目前，众多国内外的学者从该属微生物中分离得到了耐高温蛋白酶，如：Geobacillus.caldoproteolyticus（Chen等，2004），Geobacillus.subterraneus（Nazina，2001），Geobacillus.uzenensis（Nazina等，2001），Geobacillus.thermodenitrificans（Charbonneau等，2012）。本研究从蒸汽排气口土样中分离出的菌株G1201 能够产耐高温蛋白酶，经鉴定为G.thermoleovorans。比较值得注意的是，Geobacillus 属及近源的Bacillus属微生物革兰氏染色表现为阳性，而本研究中的G.thermoleovorans G1201 革兰氏染色表现为阴性。这 与 《BERGEY’S MANUAL of Systematic Bacteriology Second Edition》中对该种微生物的表述一致，G.thermoleovorans 种菌株革兰氏染色阴性和阳性结果均有发现（Bose等，2016；Paul等，2009）。推测，G.thermoleovorans 在细胞壁的进化中可能扮演了关键性角色。研究显示与G.thermoleovorans 近源的超嗜热古菌（Hyperthermophilic archaea）均为革兰氏阴性菌，两者在进化上逐渐分离，但可能保留了相同的细胞壁构成（Teuku等，2019）。

目前，对G.thermoleovorans 产高温淀粉酶（Mok等，2013）和高温脂肪酶（Abol Fotouh等，2016）有较多的研究，而对其产高温蛋白酶则鲜有报道（Teuku等，2019）。研究显示，Geobacillus 属菌株所产高温蛋白酶的适宜温度为55～ 90 ℃，适宜pH 为6～ 9（Baykara等，2021；Suleiman等，2020；Teuku等，2019；Charbonneau等，2012；Chen等，2004；Nazina，2001）。本研究中经60%硫酸铵沉淀的粗酶，最适温度为70 ℃，最适pH 为9.0，于上述结果类似。耐受性试验结果显示，该酶表现出较强的高温耐受性，在90 ℃以下均能达到酶活的80%以上，温度达到100 ℃时仍能维持50% 的酶活。同时，该蛋白酶在pH 8.0～ 12.0 的酶活均能达到90%以上，表明该酶在中性及偏碱性条件下具有良好的催化能力。与同种微生物产生的高温蛋白酶相比，G1201 所产蛋白酶具有更高的温度耐受性和pH 适应性（Teuku等，2019）。

Ca2+、Mg2+、吐温20 和Triton X-100 能够促进酶活，而Co2+、Na+、Fe2+、Zn2+、Cu2+以及SDS、DTNB、PMSF 和EDTA 则可以不同程度的抑制酶活。对温度和pH、金属离子、表面活性剂和蛋白酶抑制剂的耐受性分析表明，该酶能够耐受饲料制粒、食品烘焙和高温洗涤过程中面临的高温环境，具有良好的应用潜能。

结合该蛋白酶偏碱性的pH 适应性，以及酶活受Ca2+、Mg2+的促进作用。同时，具有丝氨酸蛋白酶家族的保守基因序列：GTSMATP（Laskar等，2011）。因此，可将该高温蛋白酶归为丝氨酸蛋白酶家族。克隆全长为1434 bp 的该高温蛋白酶基因构建大肠杆菌的表达载体pET-28a（+）-ser，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达，结果显示52.5 kD 的目的蛋白以包涵体的形式存在。包涵体是大肠杆菌表达体系中常见形式，对目的蛋白的纯化和酶活具有较大影响。近年来，通过控制细菌热休克反应来改善重组蛋白的折叠，从而避免包涵体的形成已经有一些研究进展（Overton，2014）。将来，可通过该手段改善G.thermoleovorans 源高温蛋白酶异源表达过程中包涵体形成。