羟基红花黄色素A增强LY294002对人肝癌裸鼠移植瘤生长和血管生成的抑制

宋浩然，林续涛，王东，王占青，吴娜，白咸勇，李京敏

（1山东省滨州医学院组织学与胚胎学教研室，烟台264003；2滨州医学院烟台附属医院急诊科，烟台264003；3滨州医学院附属医院肝胆外科，滨州 256600）

肝癌发病率居高不下，并且发展迅速，早期难以发现，治疗难度大。化疗药物对机体的正常细胞有很大毒副作用，而且肿瘤细胞对多数药物己产生耐药性。所以从天然的中草药中探索对肝癌有效且毒副作用小的药物仍是人们努力研究的目标。羟基红花黄色素A（hydroxylsafflor yellow A，HSYA）为红花黄色素中最主要的有效活性成分，具有抗肝纤维化作用[1,2]，对缺血-再灌注诱导的肝损伤有保护作用[3]。我们的前期研究表明，HSYA 还具有抗肝癌的药理作用：HSYA能够抑制肝癌血管生成[4]，诱导肝癌细胞发生自噬反应[5]，以及抑制肝癌细胞的侵袭、迁移和血管生成等[6,7]。本研究通过建立人肝癌细胞 HepG2裸鼠移植瘤模型，给予HSYA和PI3K阻断剂LY294002治疗，在探究HSYA是否通过在肝癌发生发展过程中过度活化及与血管生成密切相关的 PI3k/Akt通路发挥抑癌作用的同时，研究HSYA 与LY294002联合用药对人肝癌细胞 HepG2裸鼠移植瘤生长的影响。

材料和方法

1 实验材料

SPF级 BALB/c-nu雄性裸小鼠20只，5周龄，16～20 g［北京华阜康生物科技公司，合格证号：SCXK（京）2014-0004］；HSYA（上海源叶生物公司，批号：R17D7F27043，纯度≥98.2%）；人肝癌细胞株 HepG2（中国科学院细胞研究所）；PI3K 抑制剂 LY294002（大连美伦公司）；DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；兔抗人磷酸化 Akt、Akt、Cleaved Caspase-3（美 国 Cell Signaling Technology 公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 Ig G（北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗人Cleaved Caspase-3 单克隆抗体（美国Gibco公司）。

2 细胞培养

将人肝癌细胞HepG2培养于含10% FBS的DMEM培养基中，取对数生长期的细胞用于裸鼠肝癌模型的建立。

3 动物的分组及处理

将HepG2单细胞悬液分别接种于裸小鼠左前、左后、右前、右后背部腋下区域，每个部位接种细胞2×107个/150 μL。5 d后，将背部有明显隆起的裸鼠随机分为4组。对照组（Control组）：每日腹腔注射2次生理盐水，每次0.05 mL/10 g体重；HSYA组：每日腹腔注射2次，每次0.35 mg/kg体重；LY294002组：每周腹腔注射3次，每次25 mg/kg体重；联合用药组（HSYA+LY294002组）：HSYA每日腹腔注射2次，每次0.35 mg/kg体重；LY294002每周腹腔注射3次，每次25 mg/kg体重。共治疗3周。每日观察裸鼠的状态：每3 d测量一次瘤体的长、短直径，并利用公式 V=1/2ab2（a为瘤体的最长直径，b为瘤体最短直径）计算肿瘤体积及肿瘤体积抑制率，肿瘤体积抑制率=（对照组瘤体积-治疗组瘤体积）/对照组瘤体积×100%。采用脱颈法处死裸鼠，于冰上剥离肿瘤，拍照称重并计算瘤重抑制率，瘤重抑制率=（对照组瘤重-治疗组瘤重）/对照组瘤重×100%。

4 HE和免疫组织化学染色

在治疗3周后，取瘤组织置于4%多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋，按4 μm厚度连续切片。HE染色，光学显微镜下观察瘤组织病理改变。SP法免疫组织化学染色：将石蜡切片脱蜡至水，使用柠檬酸盐缓冲液高温修复抗原，3% 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，兔抗Ki-67（1:500）、Cleaved Caspase-3（1：400）、VEGF（1：200）、 p-Akt（1：400）一抗4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 Ig G（试剂盒里的即用试剂）37℃孵育30 min；滴加链霉亲和素-过氧化物酶，37℃孵育30 min；DAB显色。光学显微镜镜下观察并拍照，利用Image-proplus 6.0软件测定分析积分光密度（integral optical density, IOD）代表兔抗Ki-67、Cleaved Caspase-3、VEGF和 p-Akt免疫反应性强度。

5 统计学分析

实验数据采用 SPSS 19.0 进行统计学分析，结果以均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析各组间检测指标差异，两组之间采用SNK-q法检验比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 HSYA增强LY294002对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长的抑制

HSYA和LY294002分别对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的瘤重和体积均有抑制作用；HSYA+LY294002组的瘤重抑制率和体积抑制率均高于HSYA组和LY294002组（表1）。

表1 移植瘤体积抑制率及瘤重抑制率比较△Tab. 1 Comparison of tumor inhibitory rate of volume and weight△

2 HSYA增强LY294002对移植瘤细胞增殖的抑制和凋亡的促进

治疗3周后，HE染色显示，对照组的肿瘤细胞生长活跃，分布密集，形态多样，核大形态不规则，核质比例增大，核深染，核仁明显（图1A）。与对照组相比，HSYA组肿瘤细胞异型性减少，肿瘤组织内可见不同程度的点状坏死灶（图1B）；LY294002组可见肿瘤细胞大小不等，出现核固缩、核碎裂及细胞碎片，明显的坏死区（图1C）。HSYA+LY294002组肿瘤增殖的抑制更为明显，可见肿瘤细胞大小不等，出现核固缩及核碎裂，瘤组织中央出现明显的大片状坏死区，细胞生长活力明显下降（图1D）。Ki67免疫组织化学阳性表达位于肿瘤细胞的胞核中，呈棕黄色或棕褐色颗粒。与对照组比较，HSYA 组和LY294002组 Ki-67 的表达降低 ，但HSYA+LY294002组Ki-67 的表达降低更为显著（图2A）。Cleaved Caspase-3免疫反应阳性表达位于肿瘤细胞的胞质中，呈棕黄色或棕褐色颗粒；与对照组比较，HSYA 组Cleaved Caspase-3和LY294002组Cleaved Caspase-3水平升高，但HSYA+LY294002组Cleaved Caspase-3水平升高更显著（图2B）。

图1 HE染色观察移植瘤组织的形态学改变。A，对照组；B，HSYA组；C， LY294002组；D，HSYA+ LY294002组。箭示核固缩，箭头示核碎片，星号示坏死区；比例尺，50 μmFig. 1 HE staining and microscopic observation on morphologic changes of transplanted tumor tissues. A, control group; B, HSYA group; C, LY294002 group; D, HSYA+ LY294002 group. Arrow indicating karyopyknosis, arrow head indicating nuclear debris, asterisk showing necrotic area; scale bar, 50 μm

图2 免疫组织化学染色检测移植瘤组织中Ki-67和Cleaved Caspase-3的表达。A, Ki-67表达的代表性免疫组织化学染色结果；B，Ki-67免疫反应性的统计学分析。C，Cleaved Caspase-3表达的代表性免疫组织化学染色结果；D，Cleaved Caspase-3免疫反应性的统计学分析。比例尺，50 μm；* P < 0.05，** P < 0.01；n=3Fig. 2 Immunohistochemical examination for the expression of Ki-67 and Cleaved caspase-3 in the transplanted tumor tissues. A, representative immunohistochemical staining results of Ki-67; B, statistical analysis for Ki-67 immunoreactivity. C, representative immunohistochemical staining results of Cleaved Caspase-3; D, statistical analysis for Cleaved Caspase-3 immunoreactivity. Scale bar, 50 μm; *P < 0.05, ** P< 0.01; n=3

3 HSYA增强LY294002对移植瘤组织中VEGF和p-Akt表达的抑制

免疫组织化学染色显示，治疗3周后，HSYA 组 VEGF和p-Akt表达水平显著低于对照组，HSYA+LY294002组VEGF和p-Akt表达水平降低更显著（图3）。

图3 移植瘤组织中VEGF和p-Akt水平的免疫组织化学检测。A，VEGF水平的代表性免疫组织化学染色结果；B，VEGF免疫反应性的统计学分析。C，p-Akt水平的代表性免疫组织化学染色结果；D，p-Akt免疫反应性的统计学分析。比例尺，50 μm；* P < 0.05，** P< 0.01；n=3Fig. 3 Immunohistochemical examination for the expression of VEGF and p-Akt in the transplanted tumor tissues. A, representative immunohistochemical staining results of VEGF; B, statistical analysis for VEGF immunoreactivity; C, representative immunohistochemical staining results of p-Akt; D, statistical analysis for p-Akt immunoreactivity. Scale bar, 50 μm; *P < 0.05, ** P < 0.01; n=3

讨论

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。本研究前期工作证实，HSYA、LY294002能够抑制体外培养的人肝癌细胞的增殖、转移，促进肝癌细胞凋亡[7]。由于机体是统一的整体，药物在体内会经过吸收、代谢等众多复杂的途径才能发挥其作用[8]。因此，构建与人体内环境相似的实验动物模型来模拟人肝癌的自然演变过程，对研究肝癌的发生与发展、寻找更安全有效的治疗方法具有十分重要的意义。在本研究中，HSYA组、LY294002组的人肝癌移植瘤组织出现不同程度的坏死，HSYA、LY294002均能抑制移植瘤的瘤重和体积增长，HSYA与LY294002联合用药效果更显著。结合前期研究[7]，人肝癌裸鼠移植瘤模型和体外培养的人肝癌细胞实验均表明HSYA与LY294002联合用药抑制肝癌生长的作用更佳。

为进一步阐明HSYA联合LY294002抗肝癌的作用机制，本研究检测了移植瘤组织内增殖和凋亡等相关蛋白的表达。诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的重要治疗策略之一[9]。细胞凋亡是细胞发生异常和细胞损伤的一种重要的机制反应。在许多类型的肿瘤发生发展中存在显著的异常凋亡反应[10,11]。Caspase-3家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用[12]。在本研究中，HSYA组和LY294002组移植瘤组织Cleaved Caspase-3水平均升高，而二者联合应用时Cleaved Caspase-3水平升高更明显。因此，HSYA、LY294002均能诱导裸鼠体内肝癌细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，HSYA对LY294002有加强作用。Ki-67是一种与细胞增殖相关的核蛋白，表达于细胞周期活动期的增殖细胞中，但在静止细胞中不表达。HSYA组、LY294002组移植瘤组织Ki-67的表达均降低，联合用药组Ki-67的蛋白表达降低更明显，表明HSYA、LY294002均具有抑制肝癌细胞增殖的作用，HSYA与LY294002联合则能增强LY294002抑制肝癌细胞增殖的作用。血管在运输肿瘤细胞生长所需的氧和营养物质的过程中起着非常重要的作用，因此抑制肿瘤血管生成成为抗肿瘤治疗的研究热点[13,14]。VEGF能特异性地诱导内皮细胞的生长和增殖，从而促进血管生成和肿瘤生长[15]。另外，VEGF还抑制肿瘤细胞凋亡[16]。本研究中，HSYA、LY294002均能下调移植瘤组织中VEGF的表达，并对瘤细胞增殖有明显的抑制作用，而且HSYA与LY294002联合用药效果更佳。以上研究结果与HSYA、LY294002对体外培养的HepG2细胞作用结果一致[7]。因此，HSYA和LY294002均能抑制肝癌的血管生成，且HSYA能增强LY294002抑制肝癌血管生成的作用。

PI3K家族在多种信号通路中处于核心地位[17]。Iα型PI3K和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt 所构成的信号转导通路与多种肿瘤的发生发展、侵袭转移和血管生成密切相关。当刺激到达细胞表面时，可促使Akt发生磷酸化，从而启动下游信号通路。Akt的表达对肿瘤细胞转移、细胞活化增殖、抑制凋亡和启动血管生成具有重要的作用[18,19]。在本研究中，HSYA组、LY294002组瘤组织Akt的磷酸化水平均下调；HSYA+LY294002组Akt的磷酸化水平下降更为明显，说明HSYA能够增强LY294002对Akt磷酸化水平的下调。

综上，在裸鼠人肝癌细胞HepG2皮下移植瘤模型中，HSYA、LY294002均可抑制肝癌细胞的增殖和肝癌血管的生成，诱导肝癌细胞的凋亡；HSYA与LY294002联合应用抑制肝癌的效果更显著。HSYA通过增强LY294002抑制PI3K/AKT信号通路的作用，抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的增长和血管生成。鉴于HSYA抑制肝癌与PI3K/Akt信号通路的关联尚需进一步阐明，本研究将进一步探索HSYA抑制肝癌的具体作用靶点，并设计阻断该靶点的实验，以阐明HSYA抑制肝癌的作用机制。