银杏叶提取物对高脂饮食诱导肥胖犬脂肪沉积及脂质代谢的影响

2022-08-05卢劲晔周红蕾

中国饲料 2022年12期

陆江，卢劲晔，周红蕾

（江苏农牧科技职业学院宠物科技学院，江苏泰州 225300）

犬的肥胖症是由脂肪细胞肥大引起的，严重危害宠物犬的健康（郭世洪，2020）。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）可调控脂肪细胞分化与成熟（Lee等，2018），腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信号通路可抑制脂肪酸合成（Mariangela等，2016），均与脂肪代谢有关。银杏叶中富含多种活性成分，具有降压、降脂、抗氧化等功效（王森等，2021）。但在脂肪沉积和脂质代谢机制等方面的研究尚少，作用机制也不清晰。因此，本研究基于PPARγ与AMPK信号通路探讨银杏叶提取物对犬肥胖脂肪沉积和脂质代谢的影响，为银杏叶干预防治犬肥胖症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料泰迪型贵宾犬，雄性，3岁，体重5.5 kg左右，饲养于江苏农牧科技职业学院试验犬舍。银杏叶提取物购于泰州市中医院。基础饲粮（粗蛋白质≥24.5%，粗脂肪≥13.0%，粗纤维≤5.0%）购于上海比瑞吉宠物用品股份有限公司。

1.2 试验方法30只贵宾犬（泰迪型）适应性饲养1周后随机分成5组，分别为正常饲粮对照组（CD组）、高脂饲粮组（HFD组）、低剂量银杏叶提取物组（LGL）、中剂量银杏叶提取物组（MGL）和高剂量银杏叶提取物组（HGL）。CD组饲喂基础饲粮，HFD组饲喂高脂饲料（基础饲粮+25%猪油），各银杏叶提取物饮食组分别饲喂含1%、3%和5%银杏叶提取物的高脂饲料，试验为期8周。试验结束后第2天空腹采血分离血清，然后麻醉，迅速取腹部皮下脂肪组织，部分保存于10%中性福尔马林溶液，另一部分保存于液氮中，后转移-80℃冰箱中保存。

1.3 体重及体脂率测定试验结束后用宠物电子称测定犬的体重，用EchoMRI体成分分析仪测定体脂率。

1.4 血液生化检测用试剂盒测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，所有检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.5 HE染色检测皮下脂肪组织中脂肪细胞大小苏木精-伊红（H&E）染色如下：从福尔马林溶液中取出样品，脱水并包埋在石蜡中，脱水，包埋在石蜡中，HE染色，中性胶密封。在普通显微镜下观察图像并保存纪录，使用Image J软件计算细胞横切面面积。

1.6 qRT-PCR检测脂肪组织中脂质代谢相关因子基因表达用TRIzol法提取脂肪组织总RNA，通过逆转录合成cDNA，并用于实时荧光PCR扩增。靶基因的引物序列根据已发表的Gen Bank设计（表1）。以 β-肌动蛋白（β-actin）为内参基因，PCR扩增35个循环：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s。每个样本进行3次平行，目的基因mRNA的相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

表1 PCR引物序列

1.7 western blot检测脂肪组织中脂质代谢相关因子蛋白表达用RIPA裂解液提取皮下脂肪组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，用5×上样缓冲液配平各蛋白样品，上样进行SDS-PAGE电泳2 h，PVDF膜转膜2 h，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。按1∶2 000加兔抗Ⅰ抗AMPKα1、ACC1、CPT-1、SREBP-1、FAS、PPARγ 和 GAPDH，置于4℃摇床中孵育过夜，TBST洗膜3次。加兔抗辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗（1∶5000）室温下孵育1 h，TBST洗膜3次。化学发光成像仪中显影成像。所有抗体均购自Abcam公司。以GAPDH为内参，采用Image J分析软件对各组条带的光密度值进行分析，试验重复3次，取平均值。

1.8 数据处理试验结果用“平均值±标准差”表示，两组数据用SPSS 23.0软件t检验进行比较。P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

2 结果

2.1 银杏叶提取物对体重、体脂率及脂肪细胞大小的影响由表2可知，HFD组体重和体脂率均显著高于CD组，MGL组和HGL组的体重和体脂率均显著低于HFD组（P＜0.05），MGL组、HGL组脂肪细胞面积小于HFD组（P＜0.05）。

表2 银杏叶提取物对体重、体脂率及脂肪细胞大小的影响

2.2 银杏叶提取物对血脂代谢指标影响由表3可知，与CD组相比，HFD组TG、TC及LDL-C水平显著升高（P＜0.05），HDL-C水平显著降低（P＜ 0.05）。与 HFD组比较，MGL组 TG、LDL-C及HDL水平与HFD组差异显著（P＜0.05），HGL组TG、TC、LDL-C及HDL- C水平与HFD组差异显著（P＜0.05）。

表3 银杏叶提取物对血脂代谢指标影响 mmol/L

2.3 银杏叶提取物对脂肪组织中脂质代谢相关基因表达的影响由表4可知，与HFD组比较，不同剂量银杏叶提取物均显著提升AMPK α1的mRNA表达水平（P＜0.05）；MGL组和HGL组的 ACC-1、SREBP-1、FAS及 PPARγ 的 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），CPT-1的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。

表4 银杏叶提取物对脂肪组织中脂质代谢相关基因表达的影响

2.4 银杏叶提取物对脂肪组织中脂质代谢相关蛋白含量影响由图1可知，与HFD组比较，LGL组CTP-1蛋白表达显著上调（P＜0.05），FAS蛋白表达显著下调（P＜0.05）；MGL组和HGL组AMPK α1及CPT-1蛋白表达显著上调（P ＜ 0.05），ACC1、SREBP-1、FAS及 PPARγ蛋白表达显著下调（P＜0.05）。

图1 银杏叶提取物对脂肪组织中脂质代谢相关蛋白含量影响

3 讨论

研究表明，长期的能量摄入大于消耗会造成脂肪大量沉积，进而导致肥胖（Fu等，2016）。长期摄入脂肪能量高饲料会引起肥胖，因此，高脂饮食是动物肥胖症造模的主要方法（Grant等，2011）。在本研究中，HFD组体重、体脂率及脂肪细胞面积显著升高，表明高脂饲料是诱导犬肥胖的有效方法。给予银杏叶提取物干预后可减轻脂肪细胞肥大，改善犬肥胖指标。

AMPK信号通路是调节脂质代谢的重要通路。AMPKα1可通过抑制下游脂质代谢相关酶ACC-1、FAS和SREBP-1的表达，发挥抑制脂质合成作用（朴颖等，2022），还可激活下游分子脂肪酸β氧化关键酶CTP-1的表达，促进脂肪分解（单甄真等，2019）。本研究结果显示，银杏叶提取物可显著上调AMPK α1和CTP-1表达，显著下调ACC-1、FAS和SREBP-1表达。提示银杏叶提取物可激活AMPK信号通路，减少高脂饮食诱导犬脂质积聚。

PPARγ具有促进前脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞的作用，并可促进脂滴的形成（Fu等，2018）。本研究中高脂饮食可显著上调PPARγ的表达，银杏叶提取物干预后可逆转PPARγ的表达。提示抑制PPARγ的表达，减少前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化和脂质沉积也可能是银杏叶提取物的作用机制。