探究粪肠球菌CylA在鼠脑微血管内皮细胞中的表达及验证

李傲寒，齐亚银

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000）

粪肠球菌为肠球菌属的一个种，为球形或是卵圆形，属于革兰氏阳性菌，液体培养基中细胞呈短链状排列，为兼性厌氧化能异氧菌（Carvalho等，2004）。粪肠球菌是一种重要的机会致病菌，可以感染各种组织（王俊书等，2019），可产生多种毒力因子，进而感染人类和畜禽导致疾病。在养殖业上，粪肠球菌可引起鸡胚死亡和弱雏、死雏、家兔腹泻、鸵鸟肺部及胸腔化脓等（王蒙蒙等，2018；狄婷婷和高原，2012），尤其是引起动物脑炎和脑膜炎的病例呈上升趋势。齐亚银等（2005）对北疆地区几个不同规模羊场有神经症状的病、死羔羊的病料进行病原菌分离，成功从脑组织中分离出致病菌粪肠球菌，并通过动物实验进一步证明该菌可以穿过血脑屏障侵入脑组织，对脑组织产生破坏。血脑屏障作为控制脑内中枢神经系统稳定的重要屏障之一，严格监管进出屏障的物质。粪肠球菌对脑组织的破坏无疑会增加血脑屏障通透性。

因此，本试验通过扩增出粪肠球菌的CylA毒力基因，利用基因重组技术和转染技术将其导入到鼠微血管内皮细胞中。从mRNA转录层面和蛋白质表达层面分析粪肠球菌CylA基因的表达差异，以此来判断该基因是否与血脑屏障通透性的变化有直接关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源 由本实验室分离、鉴定并保存于-80℃冰箱的羊源粪肠球菌。

1.1.2 试剂与仪器 LB肉汤培养基、LB肉汤琼脂（均购自生工生物公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒（均购自天根生化公司）；2×Es Taq MsterMix（购自索莱宝公司）；pMD@19-T Simple Vector、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase buffer、BamhⅠ、XhoⅠ限制性内切酶、PrimeScript@ RT reagent kit 反转试剂盒（均购自TAKARA公司）；大肠杆菌Dh5α感受态细胞（购自全式金公司）；pcDNA3.1/Mychis（购自 ThermoFisher公司）；LightCycler 480 SYBR Green I Master购 自Invitrogen公 司；bEnd.3小鼠脑微血管内皮细胞（购自赛普诺有限公司）。

全自动高压蒸汽灭菌器（hIRAYAMA）、全自动震动培养箱（ZhWY-2102C）、电热恒温水浴锅（DKB-501A）、光明隔水式恒温培养箱（DNP-9162）、超净工作台（AIR TECh）、PCR 仪（TC-4000）、振 荡 器（G560E）、电 泳 仪（DYY-2C）、凝胶成像仪（Bio-Rad）、

实时荧光定量 PCR 仪（Roche LightCycler®96）。

1.2 试验方法

1.2.1 粪肠球菌DNA提取及CylA基因的克隆参照天根公司的细菌基因组提取试剂盒的说明书提取细菌DNA，-20℃保存备用。根据 Creti R等（2004）设计的引物，并结质粒上携带的酶切位点，设计特异性引物，按照2×Es Taq MsterMix12 μL、ddH2O 9 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 模板2 μL的体系进行扩增。引物序列信息如表1所示。

表1 引物序列信息

1.2.2 目的基因与克隆载体的连接及转化 将扩增产物与pMD19-T载体连接，按照SolutionⅠ 5 μL、pMD@19-T Simple Vector 1 μL、回收产物4 μL的体系置于16℃过夜孵育，随后从-80℃冰箱中取E·coli Dh5α感受态细胞放于冰盒上，加入7 μL连接产物，轻弹混匀，冰浴30 min。随后42℃水浴90 s，再次冰浴2 min。加入LB培养基混匀，37℃、180 r/min振荡1 h，复苏菌体。取出离心管，8000 r/min离心2 min，弃上清，用剩余的上清将沉淀吹打混匀，全部吸涂在含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37℃温箱中培养14～16 h。

1.2.3 重组质粒的鉴定 挑取多个单个菌落接种至含Amp抗性的LB液体培养基中，37℃培养3～4 h，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果，出现特异性目的条带的确定为阳性。提取细菌质粒，采用特异性引物进行扩增，PCR反应条件同1.2.1。将提取的质粒用酶BamhⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。

1.2.4 重组质粒的构建 在PCR管中加入双酶切后胶回收的目的基因6 μL、质粒pcDNA3.1/Myc-his；2 μL ddH2O 1μL、质粒 DNA ；2 μL、Buffer；1.5 μL、T4 DNA Ligase；1 μL 的体系进行连接，连接后再一次进行双酶切验证。

1.2.5 鼠脑微血管内皮细胞的培养 将细胞培养瓶置于含5%CO2的37℃的培养箱，每天观察细胞的生长状况，当细胞的生长密度达到或超过80%，则用胰蛋白酶将细胞消化下来后获取细胞沉淀后平均分在6孔板中培养。

1.2.6 转染鼠脑微血管内皮细胞及收集细胞蛋白 设置 24、30、36、42、48 h 五个不同的转染时间，参照Lip2000转染试剂说明书进行转染。待转染结束后应用Trizol法提取转染后的细菌总RNA于-80℃中保存备用。将转染后的细胞用高效细胞裂解液裂解，参照其说明书提取蛋白，用Western blot检测CylA基因是否在鼠脑微血管内皮细胞中表达。

1.2.7 实时荧光定量PCR反应 用Primer Premier 5.0软件设计引物，其上游为5′-CATGGRACACAAGTTGCTGGAG-3′，下 游 为5′-GCGACTCATTTCCTGCTGATG-3′，目 的 条 带大小为280 bp，退火温度为60℃。随后将提取的RNA参照反转录试剂盒合成cDNA并调整上样量，反应体系为 ：SYBR10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA1 μL。扩增体系为：95℃预变性 5 min，95℃变性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 10s，共45个循环。

2 结果

2.1 目的基因的扩增与鉴定以提取的粪肠球菌总DNA为模板，用特异性引物对其进行扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后得到如图1中大小分别为707 bp的条带，与预期的片段大小一致。

图1 CylA基因的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 CylA基因的测序结果将扩增CylA测序所得序列与GenBank上已经登录的基因序列进行同源性比对，结果显示其同源性均在99%以上。

2.3 重组质粒的酶切鉴定提取重组质粒pcDNA3.1-Myc/his-CylA，用酶BamhⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后得到如图2中大小分别为707、5500 bp的条带，目的条带与预期大小一致，质粒大小也与预期一致。

图2 CylA基因重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳

2.4 不同时间段CylA基因表达量的分析由表2可知，不同时间段CylAmRNA在细胞中表达量的变化。

表2 ylA在不同时间段mRNA的表达量

5个时间段CylAmRNA的表达量也总体呈现先下降后上升的趋势，与对照组24 h相比，42 h差异不显著（P ＞ 0.05）；30、36、48 h差异显著（P＜0.05），且36 h的表达量最低。

2.5 CylA基因的体内表达验证由图4可知，在细胞中能检测到CylA基因表达的特异性蛋白。

图4 CylA基因在微血管内皮细胞中的表达

3 讨论

从上世纪开始，关于粪肠球菌导致人和动物发病的报道逐渐增加（Guerra等，2007），成为一种机会致病菌。其致病性与粪肠球菌所携带的多种毒力因子及其产生的耐药性密不可分，粪肠球菌的Cyl基因是一种具有溶血性或溶细胞活性的性质基因，称之为溶血素，也被称为溶细胞素，最早在1934年由Todd（1934）发现，Cyl基因由6部分组成，分别是激活基因CylA、结构基因CylLL和CylLs、修饰基因CylM、转运基因CylB和免疫基因Cyll。CylA作为溶血素（Cyl）的激活基因，可激活Cyl产生溶细胞素，对体内的一些细胞有破坏作用。若CylA基因不表达，则粪肠球菌不会产生溶细胞活性，本次试验结果显示，CylA能在鼠脑微血管内皮细胞中复制并表达。有研究表明，粪肠球菌在感染小鼠后可以对脑组织造成损伤（王蒙蒙等，2018）。而本次试验证明，粪肠球菌的CylA能在鼠脑微血管内皮细胞表达，可说明CylA基因参与了粪肠球菌导致血脑屏障的损伤过程。

李慧（2019）给感染了致脑膜炎粪肠球菌的小鼠注射伊文思蓝后发现，伊文思蓝在脑组织中的量会在24 h和48 h出现峰值，且呈现先下降后上升的趋势，说明此时血脑屏障通透性变大。本试验通过测定不同时间段CylA在鼠脑微血管内皮细胞中的表达量，以24 h各基因的相对表达量为对照组，利用SPSS软件进行统计学分析显示，CylA基因36、42、48 h的相对表达量同24 h相比差异不显著（P＞0.05），30 h的相对表达量与24 h差异显著（P＜0.05）。该基因的表达量在24～48 h范围内同样呈现出先下降后上升的趋势，所得结果与李慧分析脑损伤后脑部伊文思蓝含量的变化基本相符。但由于mRNA水平的检测在转染24～48 h效果较好，因此，本试验选取的时间点相对较少，未检测24 h之前和48 h之后的表达量，没有十分精确的测量出表达量的具体变化。有研究报道，单层BEMEC相当于体外血脑屏障，本次试验结果显示，粪肠球菌CylA基因在体外血脑屏障的表达趋势与粪肠球菌感染体内血脑屏障的表达趋势一致，足以说明CylA基因在粪肠球菌突破血脑屏障的过程中起到极其重要的作用。