维生素D对慢性肾脏病小鼠认知功能的影响

李梦雨，张 森，张 丽，王德光

近年来，慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者发生认知功能障碍倍受重视，据统计，约48%的CKD患者在进入透析前已出现认知功能障碍[1]，且随着肾衰竭进展，CKD患者的认知障碍发生率逐渐增加[2]。当出现认知功能障碍时，CKD患者生活质量降低、依从性下降，从而影响其临床治疗效果、增加死亡风险。研究[3-4]表明，CKD患者血中维生素D水平明显低于健康人群，且随着疾病进展，维生素D缺乏率逐渐增加，维生素D水平降低与CKD患者认知功能减退存在关联。由于缺乏有关维生素D对CKD动物认知功能影响的报道，因此，该实验拟研究维生素D对腺嘌呤诱导的CKD小鼠学习与记忆能力的影响，以期为临床工作中改善CKD患者认知功能提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 56只SPF级雄性C57BL/6J小鼠购自安徽医科大学实验动物中心，体质量(17±1) g，动物许可证号为：SCXK(皖)2017-001，伦理审批号：LLSC20210354。小鼠采用分笼饲养的方式，统一喂养于安徽医科大学第二附属医院科研实验中心，定期更换垫料，给予充足的饲料和饮用水，动物实验室内温度(22.0±2.0) ℃、湿度50%～60%，环境自然采光和通风，12 h光照+12 h黑暗。

1.1.2实验试剂与仪器 骨化三醇(货号：SC8910，北京索莱宝科技有限公司)；肌酐测定试剂盒(货号：C011-2-1，南京建成生物工程研究所)；尿素氮测试盒(货号：C013-2-1，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(批号：20211104，南京建成生物工程研究所)；苏木精染液(批号：716092，珠海贝索生物技术有限公司)；伊红染液(批号：716101，珠海贝索生物技术有限公司)；Masson三色染色液(货号：C191201，珠海贝索生物技术有限公司)。酶标仪(型号：RT-6000，深圳雷杜生命科学股份有限公司)；电热恒温箱(型号：DNP-9052BS-Ⅲ，上海三发科学仪器有限公司)；正置荧光显微镜(型号：Axiocam 503 Color，德国蔡司公司)；水迷宫视频分析系统(型号：Morris，淮北正华生物仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组、模型建立及维生素D干预 将小鼠随机分为5组：对照(CON，n=8)组、模型(CKD，n=12)组、模型+低剂量干预(LVD，n=12)组、模型+中剂量干预(MVD，n=12)组、模型+高剂量干预(HVD，n=12)组。采用腺嘌呤饲料喂养法诱导CKD动物模型。小鼠分笼饲养，适应性喂养1周后，CON组继续给予基础饲料喂养，余4组小鼠给予0.2%腺嘌呤饲料喂养5周，5周后更换为普通饲料。造模第36天起，3组干预组小鼠分别以20、100[5]或500 ng/kg剂量腹腔注射骨化三醇，每周3次，CON组及CKD组小鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，连续给药6周。

1.2.2Morris水迷宫实验 在各组小鼠给药结束后，采用Morris水迷宫对其认知功能进行评估。将水池分为4个象限，池壁上悬挂4个不同形状的几何图案，作为小鼠辨别空间位置的视觉参照物，池内注入自来水，以无毒无味染料染白，水温控制在(22.0±1.0) ℃，水池周围悬挂蓝色窗帘以分隔研究者和实验动物，于第二象限中央放置平台，位于水下1.0～1.5 cm。实验包括：① 定位航行实验：选定四个入水位置，将各组小鼠依次分别从此四处面朝池壁轻柔地放入水中，每天入水的四个位置顺序随机，记录小鼠找到平台所需要的时间(即为逃避潜伏期)，并允许其在平台上停留10～15 s，若小鼠未能在60 s内爬上平台，则将该小鼠潜伏期记录为60 s，并用木棒将其引导至平台上，且使之停留10～15 s。所有小鼠每日于固定时间段训练，每只每次训练时间间隔半小时以上，连续训练4 d。② 空间探索实验：定位航行实验结束后，将平台从水池中撤去，依次将各组小鼠从第四象限同一入水位置放入水中，记录60 s内小鼠在原平台象限的游泳时间及路程。

1.2.3血中肌酐、尿素氮水平及SOD活性测定 小鼠眼眶取血，分离血清，-20 ℃冰箱保存，测定小鼠血清中肌酐、尿素氮含量及SOD活性。

1.2.4肾组织病理 颈椎脱臼法处死小鼠，钝性分离双侧肾脏，肉眼观察肾脏长径、色泽的改变，随之浸于4%多聚甲醛溶液中固定过夜，常规行石蜡包埋、切片、HE和Masson染色，在显微镜下进行肾组织病理学观察。

2 结果

2.1 各组小鼠基本情况对照组小鼠反应灵敏、毛发光泽，模型组小鼠日渐精神不振、易脱毛、垫料潮湿严重。整个实验过程中，无小鼠死亡。

2.2 各组小鼠血清肌酐、尿素氮含量各组小鼠血清肌酐、尿素氮水平差异有统计学意义(P<0.001)。与CON组相比，CKD组小鼠肌酐及尿素氮水平升高(P<0.001)。3组干预组小鼠血清肌酐值与CKD组相比均无统计学差异，LVD组小鼠尿素氮水平较CKD组下降(P<0.001)，而MVD及HVD组尿素氮水平与CKD组之间差异无统计学意义。

2.3 各组小鼠肾脏组织病理肉眼下，对照组小鼠肾脏形态饱满，外观红润、有光泽；模型组及干预组小鼠肾脏体积偏小，色泽苍白，表面有粗糙的颗粒状物质，见图1。光镜下，对照组肾小球及肾小管结构完整清晰，肾间质未见明显胶原纤维；模型组及干预组肾小球部分萎缩，可见炎细胞浸润、蛋白管型、间质纤维化，见图2、3。

图1 各组小鼠肾脏肉眼观A：CON组；B：CKD组；C：LVD组；D：MVD组；E：HVD组

图2 各组小鼠肾脏HE染色 ×200

图3 各组小鼠肾脏Masson染色 ×200

2.4 各组小鼠水迷宫实验结果如图4、5所示，在定位航行实验中，各组小鼠逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.01)，CKD组小鼠逃避潜伏期较CON组延长(P<0.01)，与CKD组相比，MVD、HVD组小鼠的逃避潜伏期缩短(P<0.05，P<0.05)，而LVD组小鼠逃避潜伏期与CKD组之间差异无统计学意义。见图4。在空间探索实验中，各组小鼠在原平台象限游泳时间(P<0.01)及路程(P<0.01)差异有统计学意义，CKD组小鼠在原平台象限游泳时间(P<0.01)及路程(P<0.01)较CON组减少，MVD、HVD组目标象限游泳时间(P<0.05，P<0.05)和路程(P<0.05，P<0.01)较CKD组增加，而LVD组与CKD组之间上述两项指标差异无统计学意义，见图5。

图4 定位航行实验中各组小鼠逃避潜伏期的比较

图5 空间探索实验中各组小鼠在原平台象限游泳时间及路程的比较

2.5 各组小鼠血清SOD活性各组小鼠血清SOD活性差异有统计学意义(F=32.42，P<0.001)，与CON组相比，CKD组SOD活性降低(P<0.001)，与CKD组相比，LVD及MVD组SOD活性升高(P<0.001)，见图6。

图6 各组小鼠血清SOD活性的比较

3 讨论

认知功能障碍是慢性肾脏病神经系统并发症之一，是CKD患者死亡的独立危险因素[6-7]，肾脏替代治疗、营养干预等均和认知功能有关联。维生素D作为一种多功能类固醇激素，除参与调节钙磷代谢外，对大脑功能的调节亦产生影响。多项动物实验证实，给予维生素D可显著提高阿尔兹海默病[8]、糖尿病[9]等疾病动物模型的学习和记忆能力，但尚缺乏关于维生素D对CKD小鼠认知功能的影响的研究。故本实验通过腺嘌呤饲料喂养法诱导CKD动物模型，观察维生素D对CKD小鼠认知功能的影响。

目前，CKD动物模型的制备方法包括药物、外科手术等，本研究采用0.2%腺嘌呤饲料喂养小鼠诱导CKD动物模型，从最终的生化数据看，模型组小鼠血清肌酐及尿素氮水平较对照组上升，且模型组肾脏与对照组相比在肉眼观及组织学上均有所变化，和临床实际情况较为吻合，与前人研究相比，本实验所测得尿素氮值较高，且干预组和模型组之间肌酐、尿素氮差别不大，这可能与饲料配比蛋白质含量较高有关。Morris水迷宫是用于评价啮齿类动物空间学习记忆功能的行为学实验方法之一，它利用动物逃避水环境的特性，通过视频分析系统对动物入水后寻找隐匿于水下的平台所需要的时间、搜索策略进行观察和记录，借此推断动物的认知功能。本研究结果显示，与CON组相比，CKD组小鼠逃避潜伏期延长，且在原平台象限游泳时间及路程减少，提示CKD小鼠学习记忆能力下降，这与Tang et al[10]的研究结果一致，说明在慢性肾脏病疾病状态下存在认知功能障碍。而经维生素D干预后，CKD小鼠认知功能得到改善，主要表现为MVD及HVD组小鼠逃避潜伏期较CKD组缩短，且在原平台象限停留时间及路程增加，提示维生素D可在一定程度上缓解CKD认知障碍。有研究指出[11]，过高剂量维生素D存在致死作用，但本研究过程中无实验小鼠死亡，但未对维生素D有无肝脏、骨骼等器官功能障碍进行进一步研究，维生素D发挥不同生物学效应的安全剂量范围仍需进一步探索。

既往研究表明，维生素D具有抗炎、抗氧化特性，它通过增加核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)表达、维持正常线粒体功能等途径降低氧化应激[12]。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，随之可造成机体组织不同程度的损伤，从而引起多种疾病的发生。慢性肾脏病疾病进展过程中存在严重的氧化应激[13]，在CKD早期阶段，即可发生某些氧化应激相关标志物(如：氧化型谷胱甘肽、丙二醛、8-羟基鸟嘌呤脱氧核苷等)水平的改变[14]。SOD是一种能够清除氧自由基的抗氧化酶，本研究观察到CKD组小鼠血清SOD活性较CON组下降，而与CKD组相比，LVD及MVD组小鼠SOD活性增高，提示维生素D可能通过发挥抗氧化作用改善CKD认知功能。

综上所述，CKD小鼠存在认知功能减退，维生素D或可通过抗氧化特性改善其认知，这为临床上防治CKD认知功能障碍提供了理论依据，需要更多的研究以进一步探索慢性肾脏病认知功能障碍的发病机制和防治措施。