血清HSP90α和癌组织基因HSP90AA1在肺癌中的高表达及预后价值

董晓玉，钟 涛，叶元滋，郑美娟，沈继龙

肺癌严重威胁人类健康，是癌症相关死亡的主要原因，占全球因癌症死亡人数的五分之一[1]。2020年美国新增肺癌患者约12.9万人，其中肺癌病死率占全部因癌症致死率的45%，位居病死率首位[2]。肺癌患者中大约80%～85%确诊为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)是最常见的两种组织学亚型。早期发现NSCLC对于术后良好预后至关重要，因为肺癌Ib期的5年生存率可达68%[3]，因此肿瘤标志物的监测对于肺癌的早期诊断和筛查具有优势。热休克蛋白(heat shock protein 90α，HSP90α)是近年来较热门的肿瘤筛查指标，它是调节细胞凋亡的关键因子，可在一系列癌症中高表达，有助于癌细胞的增殖、侵袭，例如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌等，HSP90α可成为癌症的一个潜在标识物[4]。该文主要探索HSP90α及癌组织基因HSP90AA1的表达在肺癌早期诊断，以及疗效和预后中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2019年8月—2021年8月在安徽医科大学附属巢湖医院住院的109例肺癌患者为实验组，其中男81例，女28例，年龄41～87(69.62±9.99)岁。本研究肺癌纳入标准：所有患者均在初诊时行纤维支气管镜或肺穿刺等经病理确诊；未经化疗、放疗及手术的首诊患者。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者。依据病理肺癌患者中鳞癌42例，腺癌41例，小细胞肺癌23例，神经内分泌癌2例，合并两种类型的肺癌(左肺鳞癌，右肺小细胞癌)1例。肺部炎症患者(包括肺部、支气管感染)36例为参照组，所有患者均符合临床诊断标准，其中男27例，女9例，年龄33～89(64.42±14.43)岁；对照组为安徽医科大学附属巢湖医院体检中心健康体检者30例，其中男14例，女16例，年龄48～92(58.73±8.73)岁。各组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。入选对象或家属均签署知情同意书。本研究经安徽医科大学附属巢湖医院伦理委员会批准(伦理编号：KYXM-202110-015)。

1.2 方法

1.2.1标本 所有入组人员均空腹静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝，用于HSP90α和异常糖链蛋白(TAP)检测；另取静脉血4 ml，无添加剂，离心(4 000 r/min，8 min)后取血清进行肿瘤标志物检测。

1.2.2实验仪器和试剂 全自动化学发光仪MAGLUMI 2000 Plus及配套试剂盒检测鳞状细胞癌相关抗原(squamous cell carcinoma associated antigen，SCC)，其参考区间临界值2.5 ng/ml为阳性判断标准；罗氏E601电化学发光仪及配套试剂盒检测胃泌素释放肽前体(prn-gastrinreleasing peptide，ProGRP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，Cyfra21-1)、糖类抗原(carbohydrate antigen，CA72-4)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，其参考区间临界值分别为85.7 pg/ml、5.0 ng/ml、3.3 ng/ml、8.2 U/ml、24.0 ng/ml为阳性判断标准；试剂为浙江瑞生医疗科技有限公司采用凝集法检测TAP，其参考区间临界值121.0 μm2为阳性判断标准；试剂为烟台普罗吉生物科技发展有限公司采用酶联免疫法检测HSP90α，其参考区间临界值82.06 ng/ml为阳性判断标准。

1.2.3HSP90AA1数据 通过癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库下载数据，分析490例肺腺癌和485例肺鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织的HSP90AA1表达。通过Survminer包中surv-cutpoint函数计算得出HSP90AA1最优分界点，将腺癌、鳞癌分为高低两组，比较两组HSP90AA1与患者临床参数的关系，同时行Cox比例风险回归分析，探究肺癌患者生存的独立危险因素。

2 结果

2.1 实验组、参照组、对照组HSP90α的比较三组间血清HSP90α水平比较有意义(Z=77.69，P<0.01)实验组高于参照组和对照组(P<0.01)，而参照组和对照组间无差异，见图1。以炎症组和体检组为阴性组，肺癌组为阳性组作ROC曲线，判断HSP90α在肺癌中的诊断效能，其曲线下面积为0.898(0.850，0.945)。以HSP90α>82.06 ng/ml为阳性判断标准，其诊断肺癌的灵敏度为79.80%，特异度为97.10%，见图2。

图1 实验组、参照组、对照组HSP90α的比较

图2 HSP90α诊断肺癌的ROC曲线与对照组比较：**P<0.01；与炎症组比较：##P<0.01

2.2 实验组HSP90α水平与肺癌其他临床参数的关系血清HSP90α在NSE阳性患者中表达高于NSE阴性者(χ2=6.594，P<0.05)；HSP90α与患者的其他临床参数无明显相关性，见表1。

表1 血清HSP90α水平与肺癌其他临床指标的关系(n=109)

2.3 实验组HSP90α水平与疗效的关系肺癌患者在治疗过程中，持续监测血清HSP90α水平，当影像学检查提示肿瘤组织缩小或临床病情缓解，HSP90α水平较初诊结果降低(t=4.428，P<0.01)；影像学检查提示肿瘤组织进一步增大或有远处转移提示病情进展，HSP90α水平较初诊结果增高(t=3.173，P<0.01)。见图3。

图3 各时期血清HSP90α水平

2.4 血清HSP90α水平在肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌中的表达血清HSP90α水平在三组间表达有意义(Z=6.058，P<0.05)；腺癌组为92.88(62.13，122.61)ng/ml，其表达低于鳞癌组104.30(85.82，141.44)ng/ml和小细胞肺癌组123.73(89.64，135.08)ng/ml(P<0.05)，而鳞癌组和小细胞肺癌组间血清HSP90α水平无差异(P>0.05)，见图4。

图4 血清HSP90α水平在肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌中的表达与腺癌组比较：*P<0.05

2.5 HSP90AA1在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达HSP90α由基因HSP90AA1表达，通过TCGA分析490例肺腺癌和485例肺鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织的HSP90AA1表达。肺腺癌和鳞癌患者，癌组织中HSP90AA1表达均高于癌旁(F=11.61，P<0.01；F=51.28，P<0.01)；腺癌组织中HSP90AA1水平表达低于鳞癌组(F=58.36，P<0.01)，见图5。由于小细胞肺癌发病率较低，TCGA没有足够的数据，故HSP90AA1在小细胞肺癌组未进行分析。

图5 HSP90ΑA1在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达

2.6 肺癌患者临床参数与HSP90AA1表达的分析通过Survminer包中surv-cutpoint函数计算得出HSP90AA1最优分界点，将腺癌、鳞癌分为高低组，比较HSP90AA1在癌组织中高表达组和低表达组与患者临床参数的关系。两组患者HSP90AA1表达水平与年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤残余均无关。腺癌患者的生存状态、疾病进展与HSP90AA1表达相关(P<0.05)，见表2；鳞癌患者的生存状态与癌组织中HSP90AA1表达无关，而疾病进展与之相关(P<0.01)，见表3。提示癌组织HSP90AA1高表达者易复发。

表2 腺癌HSP90AA1与临床参数的关系[n(%)]

表3 鳞癌HSP90AA1与临床参数的关系[n(%)]

2.7 HSP90AA1在癌组织中的表达水平与患者预后评估通过K-M生存曲线，对患者的整体生存率(OS)、无病生存率(DFI)进行分析，腺癌患者HSP90AA1高表达者OS和DFI均低于低表达组(P<0.05)，而鳞癌患者癌组织HSP90AA1表达与其预后没有统计学意义，但高表达者无病生存期有降低趋势，见图6。

图6 HSP90AA1在癌组织中的表达水平对患者的预后分析A：肺腺癌患者的OS分析；B：肺腺癌患者的DFI分析；C：肺鳞癌患者的OS分析；D：肺鳞癌患者的DFI分析

2.8 HSP90AA1表达水平是肺癌患者的独立预后因素单因素分析显示肺腺癌的TNM分期、肿瘤残余、HSP90AA1表达水平是患者的独立预后因素(P<0.05)，而患者年龄、性别与预后不相关(P>0.05)；将上述因素纳入多因素Cox回归模型分析，TNM分期、肿瘤残余、HSP90AA1的高表达是肺腺癌患者的独立预后因素(P<0.05)，见表4。肺鳞癌患者的TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、HSP90AA1表达水平是患者的独立预后因素(P<0.05)，而患者年龄、性别、TNM分期(I期、Ⅱ期)、肿瘤残余与预后不相关(P>0.05)；多因素Cox回归模型分析显示鳞癌患者的TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、HSP90AA1表达水平是肺磷癌患者的独立预后因素，见表5。

表4 影响肺腺癌患者OS的单因素和多因素Cox回归分析(n=490)

表5 影响肺鳞癌患者OS的单因素和多因素Cox回归分析(n=485)

3 讨论

HSP存在于所有生物体中，是一种高度保守的ATP依赖性分子伴侣，它参与蛋白质的重塑和激活，负责蛋白质翻译后的折叠和稳定性，促进细胞生长和增殖[5]。HSP90底物蛋白大多是过度表达或突变的基因，如p53基因、表皮生长因子受体、间质表皮转化因子等蛋白[6]，因此HSP90促进恶性肿瘤且获得耐药性，亦被称作“致癌成瘾基因”[7]。HSP90有HSP90α和HSP90β两个亚型，它们在细胞内、外水平极低；当机体微环境处于缺氧、损伤、氧化等状态，细胞内HSP90α和HSP90β释放到细胞外，仅HSP90α可变异分泌，由肿瘤细胞持续分泌至细胞外[8]。故检测HSP90α及其特异性抗体水平在癌症诊断中发挥重要作用。

该研究比较了肺癌组、肺部炎症组、健康对照组的血清HSP90α水平，肺癌患者HSP90α水平显著高于其他两组(P<0.01)；ROC曲线亦表明HSP90α在肺癌中有较高的诊断价值。近年多项研究[9-10]揭示HSP90α在肺癌患者的血清、癌组织中均上调，且其上调与肺癌的发生、发展和转归密切相关；相反，抑制Hsp90可通过复杂的信号通路抑制癌细胞的增殖、运动和转移。一份包含2 247名患者的队列研究[11]显示肺癌患者血浆HSP90α水平显著升高，且与患者分期相关。HSP90α与肺癌其他辅助诊断标志物进行比较，109例肺癌患者86例HSP90α阳性，占比78.89%，除Cyfra21-1阳性率(80.73%)，其余指标阳性率比均低于HSP90α；有3例患者肺癌筛查指标均阴性，仅HSP90α阳性，可见HSP90α对肺癌的辅助诊断有临床价值。HSP90α联合传统肺癌辅助标志物可提高其检出率，从而早发现早治疗[12]。另有研究报道[13]检测患者的肺泡灌洗液，HSP90α的诊断效率优于Cyfra21-1和NSE。该研究发现腺癌组血清HSP90α水平相对于鳞癌、小细胞肺癌较低，这与其基因HSP90AA1在肿瘤组织中的表达相似。多项研究显示HSP90α在NSCLC患者中比在对照个体中更丰富[6]。许 露 等[14]报道HSP90α联合患者临床资料对NSCLC的EGFR突变有预测价值。

由于该研究临床资料有限，为获得更多HSP90α在肺癌中表达的相关资料，通过TCGA分析了基因HSP90AA1在近千例肺癌组织中的表达。癌组织中HSP90AA1表达均高于癌旁(P<0.01)，且腺癌组织中HSP90AA1水平表达低于鳞癌组织(P<0.01)， Wang et al[15]报道HSP90AA1是促进肺鳞癌进展的相关基因。数据分析显示HSP90AA1在肺腺癌和鳞癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤分期均无关；腺癌患者的生存状态与癌组织中HSP90AA1表达相关，且HSP90AA1高表达患者OS和DFI均降低；肺鳞癌患者的生存分析显示与HSP90AA1高表达虽无统计学意义，但整体有降低的趋势。单因素和多因素Cox回归分析亦发现HSP90AA1的表达水平是肺癌患者的独立预后因素。从HSP90AA1的基因表达可以推断出HSP90α与肺癌患者的生存和预后相关，但仍需大量的临床数据支持。

该研究持续监测肺癌患者治疗过程中血清HSP90α水平，当患者肿瘤组织缩小或病情缓解期HSP90α水平较初诊结果降低；反之则增高。可见血清HSP90α水平可以监测肿瘤患者的疗效。Zhong et al[6]研究结果显示HSP90α可被认为是晚期NSCLC化疗的有价值预测因子，其水平与化疗后肿瘤缓解呈正相关。Shi et al[11]亦报道HSP90α可以预测肺癌患者对化疗的反应。

综上所述，HSP90α及HSPAA1在肺癌患者中高表达，当患者病情缓解，血清HSP90α水平降低，反之则增高；癌组织HSPAA1高表达患者预后不良。HSP90α可作为肺癌的一种辅助诊断指标，以及对肺癌的进展、疗效和预后观察具有一定的临床价值。这些为肺癌治疗的新方法—HSP90α抑制剂作为靶向药物提供了理论依据，一系列HSP90α抑制剂的设计、合成，目前已取得突破性的进展，有望应用于临床。