IL-1β诱导甲状腺细胞UGRP1表达及其与Fas/FasL介导凋亡的相关性

陈翠萍，李阿楠，任翠平，沈际佳，左春林

自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid diseases, AITD)是一种器官特异性自身免疫性疾病，主要包括Graves病(Graves’ disease, GD)和桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)两种临床类型[1]。子宫球蛋白相关蛋白1(uteroglobin-related protein 1, UGRP1)由SCGB3A2基因编码，主要在气管、支气管的上皮细胞中表达，在甲状腺组织中也有少量表达[2]。人类UGRP1基因定位在染色体5q31-33，这是一个包含一组编码大量Th2细胞因子且具有GD易感位点的基因区域[3-4]。前期研究[5-6]显示88.4% HT及24.7% GD患者甲状腺细胞中表达UGRP1，而正常甲状腺细胞及甲状腺肿瘤细胞中不表达或低表达UGRP1。GD和HT患者甲状腺组织UGRP1与自杀相关因子(factor associated suicide, Fas)共表达，并且UGRP1阳性甲状腺组织中IL-1β的表达量高于UGRP1阴性者。IL-1β主要是一种促炎细胞因子[7]，它在HT患者甲状腺组织中大量表达，是唯一诱导甲状腺细胞Fas表达的细胞因子，通过与广泛存在的FasL结合诱导甲状腺细胞凋亡[8-9]。在AITD患者尤其是HT患者的甲状腺组织中UGRP1高表达，且UGRP1高表达的甲状腺细胞中Fas表达也增高，但UGRP1高表达的具体机制、UGRP1高表达与Fas共表达之间是否存在关联尚不清楚。Fas/FasL介导的凋亡是经典的AITD致病机制，本研究通过应用IL-1β诱导甲状腺细胞，探讨甲状腺细胞UGRP1表达及其与Fas/FasL介导细胞凋亡的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂大鼠甲状腺细胞FRTL-5(美国ATCC公司)；重组人IL-1β(吴江近岸蛋白质科技有限公司)；抗FasL抗体(美国R&D公司)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；0.25 %胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司)；TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Thermo公司)；SYBR Premix ExTaq Ⅱ定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；Annenxin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及干预 将FRTL-5细胞置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5% CO2浓度的恒温培养箱中培养。当细胞生长密度达70%左右时，用胰酶细胞消化液消化，按1/2或1/3进行传代培养，或者按照合适浓度接种至细胞培养板中。用不同浓度(10、20、40 ng/ml)IL-1β刺激细胞，同时设置对照组(未加IL-1β)继续培养48 h，收集细胞用于后期检测。用IL-1β(40 ng/ml)刺激细胞，分别培养12、24、48 h，并设置对照组(0 h)，收集细胞用于后期检测。用抗FasL抗体(5 μg/ml)预处理细胞45 min后，再加入IL-1β(40 ng/ml)刺激细胞，同时设立对照组(未加IL-1β及抗FasL 抗体)、IL-1β(40 ng/ml)组继续培养48 h，收集细胞用于后期检测。

1.2.2Real-time PCR法检测mRNA 采用TRIzol法提取各组细胞总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，参考荧光定量PCR检测试剂盒说明书使用Real-time PCR仪(Bio-Rad CFX96)检测相关基因的表达水平。以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt法比较分析目的基因mRNA表达水平。引物见表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞接种于6孔板中，设置对照组、IL-1β组和IL-1β+抗FasL抗体组。对照组(未加IL-1β及抗FasL抗体)和 IL-1β组(40 ng/ml)继续培养48 h，IL-1β+抗FasL抗体组先予以抗FasL抗体(5 μg/ml)预孵45 min，再添加终浓度为40 ng/ml的IL-1β继续培养48 h。使用不含EDTA的胰酶细胞消化液消化收集细胞。按照Annenxin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪(BECKMAN COULTER)检测。记录各组的细胞凋亡率，实验重复3次。

2 结果

2.1 IL-1β对FRTL-5细胞Fas mRNA表达水平的影响与对照组相比，IL-1β组FRTL-5细胞Fas mRNA的表达水平呈剂量-时间依赖性增加。在不同浓度刺激下，20 ng/ml组(1.88±0.22)和40 ng/ml组(2.86±0.52)高于对照组(1.01±0.19)，差异有统计学意义(F=19.35，P=0.000 5)，如图1A。在不同时间作用下，12 h组(1.92±0.51)、24 h组(2.38±0.09)和48 h组(3.63±0.28)高于对照组(1.00±0.08)，差异有统计学意义(F=40.31，P<0.000 1)，如图1B。

图1 IL-1β对FRTL-5细胞Fas mRNA表达水平的影响

2.2 IL-1β对FRTL-5细胞UGRP1 mRNA表达水平的影响与对照组相比，IL-1β组FRTL-5细胞UGRP1 mRNA的表达水平呈剂量-时间依赖性增加。在不同浓度刺激下，10 ng/ml组(1.74±0.27)、20 ng/ml组(2.34±0.45)和40 ng/ml组(2.94±0.22)高于对照组(1.01±0.18)，差异有统计学意义(F=23.11，P=0.000 3)，如图2A。在不同时间作用下，24 h组(1.85±0.17)和48 h组(2.12±0.12)高于对照组(1.01±0.18)，差异有统计学意义(F=24.96，P=0.000 2)，如图2B。

图2 IL-1β对FRTL-5细胞UGRP1 mRNA表达水平的影响

2.3 IL-1β及抗FasL抗体对FRTL-5细胞凋亡率的影响流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示IL-1β(40 ng/ml)组细胞的早期凋亡率较对照组升高(7.49±1.91%vs28.46±3.17%；t=9.814，P=0.000 6)，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗体组细胞的早期凋亡率较IL-1β(40 ng/ml)组降低(28.46±3.17%vs19.20±1.75%；t=4.433，P=0.011 4)，如图3。

图3 IL-1β及抗FasL抗体对FRTL-5细胞凋亡率的影响

2.4 抗FasL抗体对FRTL-5细胞Fas mRNA及UGRP1 mRNA表达水平的影响与对照组相比，IL-1β(40 ng/ml)组，FRTL-5细胞Fas mRNA(1.01±0.09vs2.75±0.18；t=15.09，P=0.000 1)和UGRP1 mRNA(1.00±0.07vs2.22±0.31；t=6.687，P=0.002 6)表达水平增加；与对照组相比，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗体组Fas mRNA(1.01±0.09vs3.03±0.16；t=19.38，P<0.000 1)和UGRP1 mRNA(1.00±0.07vs2.66±0.28；t=9.856，P=0.000 6)表达水平增加；与IL-1β(40 ng/ml)组相比，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗体组Fas mRNA(2.75±0.18vs3.03±0.16；t=2.072，P=0.107)和UGRP1 mRNA(2.22±0.31vs2.66±0.28；t=1.811，P=0.144 4)的表达水平变化均无统计学差异。见图4A、B。

图4 抗FasL抗体对FRTL-5细胞Fas mRNA及UGRP1 mRNA表达水平的影响

3 讨论

AITD是由遗传因素、环境因素等相互作用而发生发展的一种自身免疫性疾病，辅助性T细胞在调节AITD患者甲状腺免疫反应中的重要性已得到充分证实，GD主要以Th2细胞引起的体液免疫为主，HT主要以Th1细胞引起的细胞免疫为主[10]。UGRP1作为一种功能机制尚未明确的蛋白，已被证实是甲状腺转录因子1的下游靶基因，该基因在AITD患者的甲状腺中表达升高[11]。

AITD患者，尤其HT患者甲状腺组织高表达UGRP1[5]，甲状腺细胞UGRP1阳性HT患者血清TPOAb及TgAb阳性滴度高于UGRP1阴性患者[6]，而甲状腺细胞UGRP1阳性的GD患者经过131I治疗后更容易发生甲状腺功能减退[12]，提示甲状腺细胞UGRP1阳性GD患者倾向于HT的自然转归，推测UGRP1可能作为AITD特别是HT的一种新型生物学标志物，而且对于GD患者的甲减风险有一定预警意义。UGRP1与Fas在AITD患者的甲状腺细胞中共表达，在UGRP1阳性的GD患者中，其甲状腺组织中浸润的单核细胞和巨噬细胞中IL-1β的表达量亦高于UGRP1阴性的患者[5]。本研究应用IL-1β刺激大鼠甲状腺细胞，结果显示在mRNA水平UGRP1和Fas表达呈升高趋势，与AITD患者甲状腺细胞UGRP1与Fas共表达且周围浸润的IL-1β高表达相吻合。长期以来Fas/FasL凋亡途径是AITD尤其是HT的经典通路，既往研究[9]表明IL-1β是唯一一种通过Fas/FasL通路诱导甲状腺细胞凋亡的细胞因子，为了探讨UGRP1高表达与Fas/FasL介导细胞凋亡的相关性，本研究予抗FasL抗体预孵甲状腺细胞，阻断FasL与Fas相结合[13]，降低IL-1β诱导的细胞凋亡，结果显示抗FasL抗体预孵的甲状腺细胞早期凋亡率降低，但UGRP1表达水平并未出现显著性变化。这一结果说明IL-1β诱导甲状腺细胞UGRP1高表达与Fas/FasL介导的细胞凋亡不相关。

综上所述，本研究结果表明IL-1β可以诱导甲状腺细胞UGRP1与Fas高表达，并且可以促使甲状腺细胞凋亡，但UGRP1高表达与Fas/FasL介导的细胞凋亡不相关。UGRP1与Fas/FasL介导的细胞凋亡之间的相关性仍有待进一步深入研究。