UPLC/MSMS快速筛查减肥类保健食品中6种违禁药物

韩瑨烜，寇雷，李勇，万玉炜

1. 新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院（乌鲁木齐 830011）；2. 新疆职业大学（乌鲁木齐 830011）

随着人们对纤细美学的不断追崇[1]，越来越多的减肥类保健食品被推向市场。然而保健食品向来是违禁药物泛滥的重灾区，部分不法商法为赚取暴利，通过向产品中添加如西布曲明等具有减肥功效的非法添加物以达到快速减肥瘦脂的目的。除西布曲明外，减肥类保健食品中经常添加的违禁药物还包括麻黄碱[2]、芬氟拉明、酚酞以及西布曲明的衍生物N-单去甲基西布曲明和N，N-双去甲基西布曲明等，上述药物虽然作用机理各有不同，但都可在短期内使受体达到减轻体重的作用，长期或者过量食用均会对人体造成不可逆转的损害[3]。

目前针对保健食品中违禁药物的检测方法主要有薄层色谱法[4]、分光光度法[5]、液相色谱法[6]和液相色谱-质谱法[7-8]，其中薄层色谱法只能做定性筛查，存在较高的假阳性率，通常用于初筛。分光光度法干扰因素较多，定量并不准确，特异性不强。液相色谱法定性能力较弱，选择性不强，检出后还需要质谱进一步确认。液相色谱-质谱法具有分析速度快、选择性强以及灵敏度高的优点，串联质谱仪在多反应监测模式（MRM）下还可以提供化合物二级碎片离子，因而能够对化合物进行准确的定性和定量分析[9-10]。

试验以常见的几种减肥类保健食品为研究对象，采用多反应监测模式下的超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析，通过对样品前处理条件、液相条件以及质谱条件进行优化，旨在建立一种能够同时对减肥类保健食品中6种典型违禁药物进行快速筛查的试验方法，以满足目前实验室多批次、多组分、快速筛查的需要，旨在为中国食品安全提供有力保障。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与材料

TSQ Quantis型超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪（配有ESI源和TraceFinder定量处理软件，美国赛默飞世尔科技公司）；Hettich 380R型高速冷冻离心机（德国海蒂诗公司）；ME204E型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；SDC-3000多管涡旋混匀仪（深圳逗点生物技术有限公司）；SB-800DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；

甲醇、乙腈（色谱纯，德国MERCK公司）。

6种违禁药物化合物信息与标准物质信息见表1。

表1 6种违禁药物化合物信息及对照品信息

试验用减肥类保健食品来自周边市场抽取以及公安机关送检。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备液的制备：分别精密称取5 mg酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中；准确吸取1.0 mL麻黄碱、芬氟拉明标准品至20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得到各组分浓度为0.5 g/L的标准储备液。

混合标准中间液的制备：分别从各组分标准储备液中吸取1.0 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到质量浓度为1 mg/L的混合标准中间液。

混合标准系列工作液的制备：从混合标准中间液中分别吸取2.0，1.0，0.5，0.2和0.1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇分别溶解并定容，得到质量浓度为200，100，50，20和10 μg/L的混合标准系列工作液。

1.2.2 样品溶液制备

固体样品（硬胶囊、片剂等）：样品预先均质成粉状，从中精确称取2.00 g样品至50 mL容量瓶中，加入1%甲酸-甲醇40 mL，振摇充分，超声20 min，取出后恢复至室温并用1%甲酸-甲醇定容，必要时可扩大稀释倍数，清液经0.22 μm针头滤器过滤后供超高效液相色谱-串联质谱联用仪分析。

液体样品（口服液、软胶囊等）：准确吸取样品2.0 mL至50 mL容量瓶中，其他处理步骤同固体样品。

根据实际测样的经验，有些减肥类保健食品中违禁药物的含量可能达到药物级别，为避免过高浓度的组分污染质谱系统，建议测定时先选取较大的稀释倍数，后再根据实测值对稀释倍数进行调整。

1.2.3 液相条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱温：35 ℃；进样量：1 μL；流动相：A/B=0.1%甲酸-水/甲醇；流速：0.25 mL/min；梯度洗脱程序：0～0.5 min，20% B；0.5～4 min，75% B；4～6 min，75% B；6～6.1 min，20% B；6.1～8 min，20% B。

1.2.4 质谱条件

离子源类型：电喷雾电离源（ESI）；正离子扫描；多反应监测模式（MRM）；离子源电压：3 500 V；雾化器温度：350 ℃；离子传输管温度：350 ℃；6种违禁药物液相、质谱参数详见表2。

表2 6种违禁药物液相、质谱参数

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

考虑到多数保健食品基质干扰较小以及实验室快速筛查的需要，重点考察了溶剂提取法的提取效果。溶剂提取法常采用甲醇或乙腈[11]作为提取溶剂，违禁药物多为碱性化合物，加入适量甲酸有助于提高待测组分的离子化效率，故分别测试了甲醇、1%甲酸-甲醇、乙腈、1%甲酸-乙腈四种不同溶剂的提取效果。测试结果表明，四种溶剂的提取效果由高到低依次为1%甲酸-甲醇＞1%甲酸-乙腈＞甲醇＞乙腈。因此试验选择提取效果较好且成本较小的1%甲酸-甲醇作为提取溶剂。

2.1.2 提取方法的优化

分别测试了涡旋提取5，10和15 min以及超声提取10，20和30 min的提取效果，其余试验步骤均按照1.2.2小节前处理方法重复测定两次，取平均回收率进行对比。测试结果表明，采用涡旋提取时，提取效果随提取时间的变化规律为15 min＞10 min＞5 min；采用超声波提取时，提取效果随提取时间的变化规律为30 min≈20 min＞10 min。对比两种提取方法，超声提取20 min时各组分平均回收率均显著优于涡旋提取15 min，因此试验选择超声波提取20 min作为提取方法。

2.2 液相与质谱条件优化

液相方面：试验测试了0.1%甲酸/水与甲醇作为流动相组合的分离效果，结果表明，在使用该流动相组合时，各组分响应值良好，峰型呈现也较好，且仪器故障率显著降低。色谱柱选择适合用于药物分析的Hypersil GOLD C18色谱柱，流速设为0.25 mL/min，分析总时长仅为8 min，各组分保留时间在2.188～5.119 min之间，分离效率得到显著改善。各组分离子色谱图见图1。

图1 6种违禁药物定量离子的离子色谱图

质谱方面：采用多反应监测模式（MRM），主要优化参数为各化合物的母离子、子离子、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）。优化方法：取1 μg/mL的6种违禁药物混标溶液，采用蠕动泵进样方式，首先进行母离子扫描（Q1 Scan），获取待测物的母离子，然后通过子离子扫描（Q3 Scan）获取其碎片离子，最后用MRM扫描的方式进一步优化碰撞能量、去簇电压等质谱参数。优化后各组分谱参数见表2。

2.3 基质效应评价

基质效应（Matrix effects，ME）是指由样品基质所引入，造成目标组分信号增强或减弱的现象[12-13]。试验为评价不同类型保健食品基质效应的强弱，分别选取片剂、软降囊、硬胶囊以及口服液四类保健食品的阴性样品，按照1.2.2前处理方法制备空白基质并配制基质标准曲线，再用甲醇配制溶剂标准曲线，通过计算基质标准曲线与溶剂标准曲线线性方程的斜率之比，得到各样品的基质效应（ME），ME越接近1，说明基质效应越弱。四类样本中6种违禁药物的平均基质效应计算值（ME）见表3。结果表明，6种违禁药的平均基质效应计算值均大于0.9，测定时可以采取溶剂标准曲线。

2.4 线性范围及检出限、定量限

基于优化后的液相、质谱条件，采用高效液相色谱-多反应监测质谱法对6种违禁药物混合标准工作液进行分析，并绘制标准曲线线性方程。结果表明，6种违禁药物在0.5～100 μg/L的范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。再以3倍基线噪声（S/N）确定各组分的检出限（limits of detection，SLOD），10倍基线噪声（S/N）确定各组分的定量限（limits of quantification，SLOD）。结果表明，6种违禁药物在该方法下检出限为0.5～1.0 μg/kg，定量限为1.4～3.5 μg/kg。结果详见表3。

表3 线性关系、检出限、定量限

2.5 加标回收率与精密度

采用1.2.2小节前处理方法，选取阴性样品进行加标回收试验，加标质量分数为低、中、高三个水平（20，100和500 μg/kg），每个加标浓度平行测定6次，计算平均回收率和精密度（Relative standard deviations，SRSD），结果见表4。加标质量分数20 μg/kg时，回收率为78.1%～95.3%，SRSD为3.6%～8.8%；加标质量分数100 μg/kg时，回收率为86.1%～97.2%，SRSD为4.4%～7.7%；加标质量分数500 μg/kg时，回收率为90.7%～99.3%，SRSD为3.7%～8.1%。

表4 6种违禁药物平均回收率结果（n=6）

2.6 实际样品检测

取市售和公安机关送检样品（共计50批次），采用1.2.2小节前处理方法进行测定。结果表明，50批次样品中合计检出含有西布曲明的样品8批次，检出率16%，含量差异较大，其中含量最低的为0.25 mg/kg左右，含量最高的则达到110 g/kg左右，含量超过临床用药剂量的数倍。其余5种违禁药物未见检出。

3 结论

通过优化提取溶剂、提取方法、液相色谱条件及质谱条件，建立了基于多反应监测模式下超高效液相色谱-串联质谱法对减肥类保健食品中6种违禁药物快速筛查方法，并对该方法的线性范围、加标回收率、精密度、基质效应、检出限以及定量限进行充分验证和评价，后又将该方法应用于多种减肥类保健食品的实际样品测定过程，并检出含有西布曲明成分的样品。该试验方法具有操作简单、成本较低、分析快速、回收率高等优点，能够充分满足检测实验室针对减肥类保健食品中违禁药物快速筛查的需求。