自由基接枝改性对乳清分离蛋白乳化稳定性的影响

林佳宜，郑佳纯，李 雁，解新安，李 璐

（华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）由β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白以及免疫球蛋白组成[1]，具备优良的乳化性，常作为大分子稳定剂，用于构建纳米乳液体系。WPI 作为乳化剂虽绿色安全，但热稳定性差，在酸性条件下容易出现絮凝和沉淀[2]。因此常用物理或化学的方法对其进行改性，以增强乳液的稳定性[3]。

研究表明，蛋白质与多酚之间可通过酶诱导、碱法和自由基接枝法来实现修饰改性，生成兼具抗氧化性及乳化性的交联产物[4]。自由基接枝是通过蛋白质侧链上的活性基团和羟基自由基发生反应，使多酚与蛋白质之间形成共价键，共价键生成涉及不可逆的相互作用，从而形成更稳定的结合物[5]。较于酶法和碱法，自由基接枝法在反应过程中不涉及有机溶剂，且具有较高的安全性，被广泛应用于食品工业中。目前对于蛋白质-多酚的接枝改性研究主要集中在改性对蛋白结构和功能特性的改变及提高上，如Lu 等[6]通过自由基接枝法制备卵清蛋白（OVA）-绿原酸（CHA）接枝物并对其抗氧化活性进行测试，发现与未改性OVA 相比，OVA-CHA 接枝物的抗氧化活性大幅提高。Yi 等[7]则通过自由基法制备β-乳球蛋白（BLG）-儿茶素接枝产物并用于制备β-胡萝卜素纳米乳液，发现在不同温度下储藏30 d 后BLG-儿茶素接枝物能显著提高包封在纳米乳液中β-胡萝卜素的保留率，对多酚接枝对蛋白界面流变性及乳化稳定性的影响等研究较少。

表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）是多酚中黄烷醇类物质的主要活性成分，也是绿茶中含量最高的儿茶素，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种功效[8-9]。基于此，本文以EGCG作为多酚代表，通过自由基接枝法制备WPI-EGCG复合物，探究接枝EGCG 对WPI 界面流变性能及其所构建纳米乳液稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清分离蛋白（HPLC≥90%） 上海江莱生物技术有限公司；表没食子儿茶素没食子酸酯（HPLC≥98%）、番茄红素（HPLC≥90%） 上海源叶生物技术有限公司；中链甘油三酯（MCT） 广州耶尚贸易公司；过氧化氢（30%） 广东省光华科技有限公司；抗坏血酸 广州化学试剂厂；Folin-酚试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；叠氮化钠 合肥天健化工有限公司；二甲基亚砜 天津市富宇试剂厂。

ATS AH-BASIC 高压均质机 江苏ATS 工业系统有限公司；FJ200 高速分散均质 搅拌器上海弗鲁克流体机械制造有限公司；EVO MA 15 扫描电子显微镜 德国蔡司；MCR502 模块化智能型高级流变仪 奥地利Anton Paar。

1.2 实验方法

1.2.1 WPI-EGCG 接枝产物的制备 根据Gu 等[10]所述的方法稍作修改制备接枝物，用蒸馏水配制1%（w/v）的WPI 溶液，加入摩尔比为5:1.4 的过氧化氢和抗坏血酸作为引发剂，25 ℃水浴恒温振荡2 h 后加入EGCG 反应24 h，将得到的溶液进行透析，冷冻干燥，备用[11]。

1.2.2 扫描电子显微镜（SEM）观察 将待测样品粉末固定在导电双面胶带上，在真空条件下将样品溅射镀上10 mm 厚的金层，在20 kV 的加速电压和450 倍的放大倍数下观察粉末的表观形态。

1.2.3 空白乳液制备 以中链甘油三酸酯（MCT）为分散相，将WPI-EGCG 接枝物和WPI 溶解于磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH7.0）中，配制浓度分别为0.3%、0.5%、0.7%、1%、1.5%（w/v）的连续相，在25 ℃下100 r/min 磁力搅拌4 h。分散相与连续相按9:1的比例混合，在高速分散机的作用下以10000 r/min分散5 min 制得粗乳液，再经高压均质机在110 MPa下循环均质3次以形成O/W 纳米乳液。

第三个驱动是装备制造业和新经济发展。今年以来，传统行业用电低速增长的同时，新兴产业用电增速遥遥领先。前三季度，汽车制造业、金属制品业、计算机通信设备制造业、通用设备制造业用电增速均超10%。服务业中的数据中心等用电量大幅增长。

1.2.4 界面吸附蛋白含量的测定 将空白乳液在11000 r/min 下离心1 h，用一次性注射器吸出下清液后经孔径0.22 μm 的针筒过滤器（水系）过滤，再次在11000 r/min 下离心至水层中无乳脂析出。采用Folin-酚试剂盒测定水层中蛋白含量，取5 mL Folin-酚试剂加入到1 mL 水相中在室温下反应10 min，再加入0.5 mL Folin-酚试剂乙反应30 min，500 nm 处测量吸光度值[12]。

式中：C0指乳液中总蛋白的浓度，mg/mL；C1指未吸附到界面上的蛋白浓度，mg/mL。

1.2.5 乳液流变学特性的测定 采用流变仪测定乳液的流变学特性，用不锈钢平板探头分别进行剪切模式扫描和频率扫描。常温下将刚制备的空白纳米乳液倾倒在测量平台平铺，设置间隙为1 mm，除去多余乳液。频率扫描的参数设置为：应变0.1%，频率扫描范围1～100 Hz。剪切模式扫描的参数设置为：0.1～100 s-1[13]。采用Ostwald/de waele 流动曲线模型对数据进行分析。

式中：η为表观黏度；γ为剪切速率（s-1）；K 为黏度系数（Pa·sn）；n 为流动指数。

1.2.6 番茄红素纳米乳液的制备 分别以WPI-EGCG接枝物和WPI 作乳化剂，以中链甘油三酸酯（MCT）为分散相，构建负载番茄红素的纳米乳液体系。具体做法如下：将WPI 和WPI-EGCG 分别溶解于磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.0）中，配制0.7%的WPI和WPI-EGCG 蛋白溶液，加入0.02%（w/w）叠氮化钠抑制微生物生长。蛋白溶液在25 ℃下100 r/min磁力搅拌4 h，形成水相。MCT 油中分散0.3%（w/w）的结晶番茄红素标品，以此为油相。在高速分散机的作用下将油相加入水相中，以10000 r/min 分散5 min制得粗乳液，再经高压均质机在110 MPa 下循环均质3次，以形成O/W 纳米乳液[14]。

1.2.7 纳米乳液粒径及电位的测定 利用纳米粒度及ζ-电位分析仪测定纳米乳液的粒径及电位。将乳液样品稀释100 倍后吸取适量于石英比色皿（电位测定用其专用比色皿）中，测试的参数为：水的折射率为1.33，测试温度为25 ℃，每个样品平行测定三次，取平均值。

1.2.8 番茄红素保留率的测定 取800 μL 的二甲基亚砜与200 μL 的番茄红素纳米乳液混合，加入2 mL的混合有机相（正己烷:二氯甲烷=3:1，v:v）进行萃取，重复3次后上清液装入离心管中在4000 r/min下离心15 min，取上层清液在472 nm 波长处测定番茄红素的吸光值。根据标准曲线计算得出番茄红素含量，标准曲线为A=0.052C-0.008，相关系数r=0.9969。以正己烷为空白对照。

式中，C2为在储藏时间t 时乳液中番茄红素的浓度，μg/mL；C3为储藏前乳液中番茄红素的浓度，μg/mL。

1.2.9 番茄红素乳液的微观结构观察 将番茄红素乳液稀释10 倍，取15 μL 的稀释液滴到显微镜载玻片的中间位置并盖上盖玻片，静置10 s 后使用光学显微镜在10 倍的放大倍数下观察番茄红素乳液的微观状态，并用数字图像分析软件MS Shot 软件拍照保存图像。

1.3 数据处理

本论文所有实验均重复三次或以上，数据均以平均值±标准差表示。使用SPSS 20.0 进行数据的计算整理和统计分析，Origin 2019 软件作图，选择Duncan 多重范围检验进行数据间的显著性分析，P＜0.05 为差异显著，图中同种物质的不同字母表示具有显著性差异，不同物质之间用大小写进行区分。

2 结果与分析

2.1 SEM 分析

图1为WPI 和WPI-EGCG 在放大倍数为450倍下的SEM 观察结果。可以看出，WPI 和EGCG的共价相互作用导致其微观结构发生变化。EGCG分子中含有较多的羟基，在接枝反应中易与蛋白质发生相互作用[15]。WPI 具有典型的球蛋白光滑球状结构，接枝后的WPI-EGCG 复合物球状结构消失，呈现出致密的片状结构,表明WPI 和多酚之间的共价相互作用破坏了蛋白质的有序结构，使蛋白质的侧链解开并重新排列成片状结构[16]。这与Zhao 等[17]从大豆分离蛋白-EGCG 共价复合物的研究结果相一致。

图1 WPI 和WPI-EGCG 接枝物的SEM 图Fig.1 SEM images of WPI and WPI-EGCG grafts

2.2 界面蛋白吸附量

具有两亲性质的蛋白质作为乳化剂在界面上会自发从体相内向界面吸附[18]，通过降低界面张力来形成吸附膜，从而达到稳定乳液体系的目的。因此，蛋白乳化剂在界面上的吸附动力学、展开和重排、界面蛋白吸附量等界面行为与乳液稳定性有密切联系[19]。一般来说，界面蛋白吸附量越高，蛋白吸附至水油界面的能力越强，乳液就越稳定[20]。不同浓度下WPI和WPI-EGCG 在MCT 油-水界面上的界面蛋白吸附量结果见图2。

图2 WPI 和WPI-EGCG 接枝物在油-水界面的蛋白吸附量Fig.2 Interface protein adsorption capacity of WPI and WPIEGCG grafts

由图2 可得，随着蛋白浓度的增大，WPI 作乳化剂的界面蛋白吸附量呈现出先增大后减小的趋势，且在浓度为0.7%时，界面蛋白吸附量达到最大（8.04 mg/mL）；而接枝后的WPI-EGCG 复合物稳定的乳液的界面蛋白吸附量随着蛋白浓度的增大而不断增大，且始终大于WPI（P＜0.05）；WPI-EGCG 接枝物在蛋白浓度为1.5%时，界面蛋白吸附量可达12.7 mg/mL。界面蛋白吸附能力与蛋白结构的分子构象柔顺性和表面疏水性相关，据此推测WPI-EGCG 界面吸附量增大的原因可能是EGCG 的自由基接枝改性使WPI 的分子结构发生了变化[21]。WPI 在自由基介导作用下，更多展开的疏水性残基和具有表面活性的多肽移动到油水界面层上并吸附到小油滴上，导致界面吸附量增大[22-23]。在油水界面吸附过程中，WPIEGCG 展示出比WPI 更好的界面吸附能力，可能是因为自由基接枝反应引起WPI 的柔性发生变化，促使WPI-EGCG 能更加均匀地分散在乳液中，并且稳定存在[24]。

2.3 流变学特性

界面流变特性是与以蛋白质为乳化剂乳液的长期稳定性相关的重要物理参数。界面剪切流变学可以通过测量黏度的变化来监测聚合物在油/水界面处的吸附动力学[25]。乳液黏度是评价乳液稳定性的一个重要指标，其值越大，代表乳液的小液滴发生沉淀或者上浮的速度越慢，乳液的物理稳定性越高[26]。

对不同浓度WPI 和WPI-EGCG 构建的空白乳液进行稳态剪切扫描，分析在1～100 s-1范围内剪切速率对表观黏度的影响，结果如图3所示。可以看出，不同浓度下的WPI 和WPI-EGCG 空白乳液的表观黏度均随剪切速率的增大而先急剧下降，而后趋于平缓，呈负相关关系。当剪切速率在0.1～20 s-1范围内变化时，二者均表现出了假塑性流体的剪切稀释特性，后面随着剪切速率进一步的增加，二者的黏度不再变化，并且与剪切方向平行，表现出牛顿型流体特征。WPI 和WPI-EGCG 乳液的黏度随着蛋白浓度的增大而增大，不同浓度下WPI-EGCG 空白乳液的黏度值均高于WPI，原因可能是以蛋白质自由基接枝物为乳化剂制备的乳液液滴之间的相互作用增强，液滴之间的吸引力驱动聚合物的形成，从而在内部空间形成颗粒的网络结构导致黏度增加[27]。但是在高剪切力作用下，WPI 和WPI-EGCG 乳液的内部结构随着剪切速率的增大而逐渐被破坏，聚合物变形破裂成小液滴，并在剪切力场下重新分布，使其流动阻力变小，因而二者均表现出剪切稀释特性[28]。

图3 不同浓度WPI 和WPI-EGCG 制备的空白乳液的表观黏度随剪切速率的变化Fig.3 Changes of apparent viscosity of blank emulsions prepared by different concentrations of WPI and WPI-EGCG varies with shear rates

采用Ostwald/de Waele 流动曲线模型对数据进行拟合分析，结果见表1。静态流变拟合参数测定结果中决定系数R2＞0.99，表明此模型能较为准确地反映WPI 和WPI-EGCG 乳液的表观黏度与剪切速率之间的关系。当n＜1 时，乳液会表现出剪切减薄行为，且n 值越低，乳液剪切减薄行为越明显，由表1可知，WPI 和WPI-EGCG 乳液均呈现假塑性流体特征（n＜1），说明在高速剪切力下，由弱吸引力形成的网络结构被破环，这与图3 表观黏度随剪切速率的增大而减小实验结果相互验证。不同浓度的WPI 和WPI-EGCG 的空白乳液流变学测试表明自由基接枝后的WPI-EGCG 乳液具有更高的黏度，物理稳定性也更强。

表1 不同浓度WPI 和WPI-EGCG 制备的空白乳液的静态流变拟合参数Table 1 Static rheological fitting parameters of blank emulsions prepared with different concentrations of WPI and WPI-EGCG

2.4 以WPI 和WPI-EGCG 为乳化剂构建的番茄红素纳米乳液稳定性研究

在储藏的周期范围内，如果乳液液滴的大小分布、表面电荷，聚集状态或在容器内的空间分布方面没有明显的变化，说明乳液的物理稳定性越高。乳液的化学稳定性是指在一定的储藏时间内负载的功能活性物质含量的变化情况，保留率越高，代表化学稳定性越好。因此，以WPI-EGCG 为乳化剂，WPI 为对照，通过测定负载番茄红素的纳米乳液在37 ℃下储藏30 d 内粒径、ζ-电位和番茄红素的保留率，来评价经过EGCG 自由基接枝改性后的WPI 乳化性能的变化。

2.4.1 粒径及电位变化 纳米粒度仪测出的由0.7%WPI 和0.7% WPI-EGCG 接枝物制备的番茄红素纳米乳液的初始平均粒径分别为356 和406 nm，即接枝后的复合物在初始状态下粒径较大，这是共价接枝作用使得复合物的分子量增大的缘故。高压剪切力的作用使得乳液被分散为小液滴并趋于稳态，但由于复合物作为乳化剂向油水界面处吸附时液滴产生碰撞形成了大液滴，致使其粒径的增大[29]。Gu 等[11]的研究中也同样发现，未接枝的蛋清蛋白的粒径比经过儿茶素接枝的粒径更小。

从图4 可以看出，随着储藏时间的增加，两种乳液体系的粒径均呈现不同程度的增加趋势，到了第30 d 时的平均粒径分别增加至799.1 和674.3 nm，由WPI 稳定的乳液粒径增长速度比WPI-EGCG 接枝物制备的乳液增长速度快，WPI-EGCG 接枝物还是表现出比WPI 更好的物理稳定性，这可能是因为共价修饰改善了WPI 的两亲性，使得接枝产物降低界面张力的效果更好。另外，由前面界面蛋白吸附量测定实验结果可知，WPI-EGCG 接枝物在油水界面上具有更好的界面吸附能力，同样也会增强乳液体系的稳定性。

图4 37 ℃下0.7%的WPI 和WPI-EGCG 构建的番茄红素纳米乳液的粒径和电位变化情况Fig.4 Changes of particle size and potential of 0.7% WPI and WPI-EGCG nano-emulsions at 37 ℃

ζ-电位是蛋白表面电荷量的表征，可作为乳液体系稳定性的衡量指标[30]。一般来说，电荷绝对值越大，说明乳液体系越稳定，因其所带电荷多，彼此间斥力大，使得油脂分子不易聚集[31]。由图4 电位测定结果可看出，随着储藏时间的增加，乳液的ζ-电位也随之下降。其中，由WPI 制备的番茄红素纳米乳液在30 d 储藏期内，其电位绝对值降低了23.4 mV，在第30 d 时的电位值达到了-22.3 mV，而WPI-EGCG制备的番茄红素纳米乳液在30 d 储藏期内，其电位绝对值仅降低了17.6 mV，在第30 d 时的电位值为-34.4 mV，说明以WPI 为乳化剂构建的乳液体系不稳定，这可能是因为仅由纯蛋白质稳定的乳液液滴的电荷相对较低而导致絮凝，负电荷降低的同时也伴随着静电或空间排斥力的降低，疏水相互作用或范德华力开始占主导地位[32]。随着WPI-EGCG 浓度的增大，由其制备的乳液ζ-电位之间的变化量较小，且电位值始终高于WPI 的番茄红素纳米乳液，说明EGCG的自由基接枝改性改善了WPI 的物理稳定性。

2.4.2 番茄红素保留率 由图5 发现，两种乳化剂稳定的番茄红素纳米乳液的保留率均随着储藏时间的延长而降低，在储藏30 d 时，WPI 稳定的番茄红素纳米乳液番茄红素保留率为35.49%，而WPI-EGCG接枝物稳定的番茄红素纳米乳液保留率可达到66.23%，表现出更好的番茄红素保护效果。这可能是因为EGCG 具有强表面活性，会阻止番茄红素和单线态氧或其它自由基之间发生氧化还原反应[33]。同时，EGCG 改善了WPI 的乳化活性，使其更加迅速的吸附至油水界面，对番茄红素提供了有效的保护[34]。Jiang 等[35]的研究中同样发现在14 d 的储存期内，用α-乳白蛋白-儿茶素接枝物稳定的β-胡萝卜素的保留量明显大于α-乳白蛋白，这归因于用儿茶素接枝改性后增强了α-乳白蛋白清除自由基和结合游离金属离子的能力。

图5 37 ℃下0.7%的WPI 和WPI-EGCG 构建的番茄红素纳米乳液中番茄红素保留率的变化情况Fig.5 Lycopene retention rate of 0.7% WPI and WPI-EGCG nanoemulsions at 37 ℃

2.5 番茄红素纳米乳液微观形态

通过光学显微镜对不同贮藏时间下的WPI 与WPI-EGCG 为乳化剂构建的番茄红素纳米乳液进行观察，结果如图6所示，发现在第0 d 时，二者的乳液体系未出现液滴聚集现象，乳液液滴颗粒清晰可见；第15 d 时，WPI 稳定的乳液已开始出现少量聚集的现象，且液滴颗粒附着在聚集物上，这可归因于乳液液滴的重力作用及布朗运动，在高温下加速了液滴之间的碰撞频率形成一个大的聚集体，从而导致粒径的增大[36]；第30 d 时，WPI 乳液液滴变化最为明显，出现了大规模的聚集结构。相反，由WPI-EGCG 稳定的番茄红素纳米乳液在储藏30 d 后仅看到有少量的聚集现象，说明经由自由基接枝改性作用后制备的乳液的乳化稳定性更好，这可能是因为其表面负电荷较高，因此增强了液滴之间的静电排斥力并改善了WPI的抗絮凝和聚结的性能[37]。

图6 WPI 和WPI-EGCG 构建的番茄红素纳米乳液不同贮藏时间的光学显微镜图Fig.6 Optical microscopy of lycopene nano-emulsion constructed by WPI and WPI-EGCG after standing for different days

3 结论

本文通过制备WPI-EGCG 复合物研究自由基接枝改性对WPI 乳化稳定性的影响，结果发现自由基接枝后的WPI 球状结构消失并转变为片状结构，在油水界面吸附过程中，WPI 在蛋白浓度为0.7%时界面蛋白吸附量达到最大值8.04 mg/mL，而WPIEGCG 接枝物在蛋白浓度为1.5%时界面蛋白吸附量可达12.7 mg/mL，WPI-EGCG 展示出比WPI 更好的界面蛋白吸附能力。流变学行为结果则显示，经EGCG 接枝改性后的WPI 乳液黏度更大。在37 ℃下储藏30 d 后，与未改性WPI（番茄红素保留率的35.49%）相比，以同浓度WPI-EGCG 为乳化剂构建的番茄红素纳米乳液（保留率为66.23%）具有更好的储藏稳定性，且在相同储藏温度下粒径和ζ-电位的增长幅度最小，同时微观结构中也没有观察到明显的聚集现象，表现出相对较好的抗絮凝和聚结性能及乳化稳定性。以上结果表明，WPI-EGCG 自由基改性可以提高蛋白的界面及流变特性，进而有效提高载运体系的稳定性及负载物的保护效果。本研究可为具有长期物理稳定性及高保留率的功能活性物质纳米乳液载运体系的构建提供参考。