芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及机制

李远颂， 何荣荣， 蔡佳欣， 陈 达， 陈文学,*

(1.天津大学 精密仪器与光电子工程学院， 天津 300072； 2.海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228； 3.海南大学 研究生处， 海南 海口 570228)

食源性疾病已成为食品安全和公共卫生领域关注的重要问题，致病菌污染是引起食源性疾病的主要原因。假单胞菌属可以产生蛋白酶、脂肪酶等多种酶，是冷藏和有氧条件下肉品中的优势腐败菌和致病菌[1]。莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)是一种隶属于假单胞菌属的革兰氏阴性细菌，广泛存在于冷藏肉及肉制品中[2]，极易导致肉品变质。食品工业中常采用添加防腐剂的方法进行食品防腐，然而化学防腐剂的长期使用、超标使用或非法使用，会对人体健康造成一定损害，如诱癌、致畸、食物中毒等[3]，也会导致细菌的耐药性问题[4]。天然防腐剂根据来源不同可分为植物源、动物源和微生物源三种[5]，因其具有抑菌性强、安全性高、来源范围广、风味影响小等优点，已成为食品添加剂研究的热点领域。天然植物源中提取的植物精油在具有上述优点的同时，还富含大量生理活性物质，对关注食品安全和生命健康的消费者及研究者来说更具吸引力[6]。

芳樟醇(3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇)，别名里那醇，是一种无色或浅黄色、易挥发的液体，存在于多种植物精油中。芳樟醇具有较高的安全性，我国食品安全国家标准GB 1886.148—2015将芳樟醇列入食品添加剂，美国食品和药物管理局将芳樟醇归类为“公认安全使用物质”(GRAS)[7]。芳樟醇可用作天然食用香料，也可用于配制食用香精，在食品生产加工过程中常用作增香剂和调味剂；同时，芳樟醇具有良好的抗菌活性。研究表明，芳樟醇对铜绿假单胞菌[8]、荧光假单胞菌[9]、腐败希瓦氏菌[10]和大肠杆菌[11]等细菌均表现出较强的抗菌活性，对白色念珠菌[12]、皮肤癣菌[13]等真菌也具有抑菌活性，气相的芳樟醇对大肠杆菌也具有较强的气相抗菌活性[14]。研究认为，芳樟醇在活性食品包装中具有应用前景，可通过微胶囊化[15]、制备抗菌膜[16]等方式释放其抗菌活性，延长食品的保质期。目前，芳樟醇的抑菌机制尚不明确，有关芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及机制的研究鲜有报道。

本研究拟以莓实假单胞菌为指标菌，探讨芳樟醇对其抑菌活性及作用机制。通过测定芳樟醇的最小抑菌浓度(MIC)，判断其抑菌作用强弱；采用紫外分光光度法测定指标菌的生长曲线，评价芳樟醇的抑菌活性；通过扫描电子显微镜观察、结晶紫染色实验、二乙酸荧光素(FDA)染色实验以及测定电导率、核酸泄漏、呼吸代谢活力和呼吸链脱氢酶活性的变化，考察芳樟醇对莓实假单胞菌细胞结构的破坏作用和呼吸代谢的抑制作用，探究芳樟醇对指标菌的抑菌机制，希望为其应用于食品保鲜和开发天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莓实假单胞菌(CGMCC1.3349)，中国普通微生物菌种保藏管理中心。

芳樟醇，海南康馥纳生物有限公司；营养肉汤、琼脂、无菌磷酸盐缓冲液(PBS，浓度为0.1 mol/L，pH值7.4)、二乙酸荧光素(FDA)、碘硝基氯化四氮唑蓝(INT)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、无水乙醇、甲醇、丙酮、盐酸、正丁醇，广州化学试剂厂；结晶紫、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)，上海源叶生物科技有限公司；无水葡萄糖，西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

AR124CN型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；GI54DS型高压灭菌锅，致微(厦门)仪器有限公司；SPX- 288型生化培养箱，宁波江南仪器厂；SW- CJ- 1FD型无菌超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；TU1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用设备有限责任公司；Verios G4 UC型扫描电子显微镜，赛默飞世尔科技布尔诺有限公司；SP- Max3500FL型多功能酶标仪，上海闪谱生物科技公司；SHA- 2型恒温振荡器、HH- 4型数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；CR22N型落地式高速冷冻离心机，日本日立(Hitachi)工机有限公司；F- 280型荧光分光光度计，天津港东科技发展股份有限公司；DDS- 307型电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1菌种活化与菌悬液制备

将莓实假单胞菌接种在营养肉汤琼脂培养基中，置于培养箱中30 ℃培养18～24 h，进行传代活化。

莓实假单胞菌培养至对数生长期，用无菌生理盐水(质量分数为0.9%的NaCl)洗脱，菌悬液以6 000 r/min低温离心10 min，所得菌体用无菌生理盐水洗涤2次并重悬；采用麦氏比浊法[17]，将菌悬液的浓度调至106～107CFU/mL备用。

1.3.2最小抑菌浓度的测定

采用培养基稀释法[18]测定芳樟醇对莓实假单胞菌作用的最小抑菌浓度(MIC)。将芳樟醇溶解于体积分数为1%的乙醇溶液后，稀释配成浓度(芳樟醇含量)分别为120.00、60.00、30.00、15.00、7.50、3.75 mL/L的抑制液。取2 mL不同浓度的抑制液分别与18 mL温度为40～60 ℃的营养肉汤琼脂培养基混匀，使芳樟醇的终浓度分别为12.000、6.000、3.000、1.500、0.750、0.375 mL/L；以加入等量无菌水、1%乙醇溶液分别作为空白组和阴性对照组。培养基凝固后，取100 μL菌悬液于平板上均匀涂布，30 ℃下培养24 h；观察菌落情况，以肉眼看不见细菌生长的最小稀释浓度作为MIC。

1.3.3细菌生长曲线的绘制

采用紫外分光光度法[19]测定莓实假单胞菌的生长曲线。按1.3.1方法制备菌悬液，以5%(体积分数)的接种量接种于液体营养肉汤培养基中；以加入浓度为1倍MIC(1MIC)和2倍MIC(2MIC)的芳樟醇为实验组，按1.3.2方法设置空白组和阴性对照组，于30 ℃、150 r/min摇床培养，每隔2 h取样，并测定600 nm处的吸光值(OD600)，连续24 h。以培养时间为横坐标，所测吸光值为纵坐标，绘制莓实假单胞菌的生长曲线。

1.3.4细菌细胞形态观察

参照Yi等[20]的方法并做适当修改。制备菌悬液并设置实验组、空白组和阴性对照组，于30 ℃、150 r/min摇床培养。分别取培养4、8 h的菌悬液离心，菌体用PBS洗涤3次后，用乙醇溶液(20%、40%、60%、80%)进行梯度脱水并用无水乙醇洗脱3次，于-20 ℃预冻后再真空冷冻干燥12 h，取完全干燥的菌体上样、镀金，用扫描电子显微镜放大8 000倍观察细菌细胞形态。

1.3.5结晶紫染色实验

结晶紫染色实验参照Kang等[21]的方法并做适当修改。制备菌悬液并设置实验组、空白组和阴性对照组，于30 ℃、150 r/min摇床培养。分别取培养4、8 h的菌悬液，6 000 r/min低温离心10 min，菌体用PBS洗涤3次，与结晶紫溶液混匀，室温避光孵育15 min，离心取上清液，测定其OD590值。

1.3.6二乙酸荧光素染色实验

二乙酸荧光素(FDA)染色实验参照曾哲灵等[22]的方法并做适当修改。制备菌悬液并设置实验组、空白组和阴性对照组，于30 ℃、150 r/min摇床培养。分别取培养0、4、8 h的菌悬液离心收集菌体，PBS洗涤后离心弃上清液，加入250 μL质量浓度为2 mg/mL的FDA-丙酮溶液，共同孵育20 min，低温离心，用PBS洗涤3次并重悬，用荧光分光光度计测定其平均荧光强度。

1.3.7电导率的测定

电导率的测定参照Diao等[23]的方法并做适当修改。莓实假单胞菌培养至对数生长期，将菌悬液离心，用PBS洗涤3次并重悬；设置实验组、空白组和阴性对照组，每隔15 min用电导率仪测定1次菌悬液的电导率，连续90 min。

1.3.8核酸泄漏的测定

核酸泄漏的测定参照Shi等[24]的方法并做适当修改。制备菌悬液并设置实验组、空白组和阴性对照组，于30 ℃、150 r/min摇床培养。取培养0、2、4、6、8 h的菌悬液低温离心10 min，分别测定各上清液的OD260值并绘制曲线。

1.3.9呼吸代谢活力的测定

取培养至对数生长期的菌悬液低温离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次并重悬，将重悬液浓度调至OD600为0.5。向所得重悬液中加入不同浓度的芳樟醇，设置空白组和阴性对照组，于30 ℃、150 r/min摇床培养。分别取培养0、2、4、6、8、10 h的菌悬液低温离心，所得菌体用无菌生理盐水洗涤3次，重新将菌体的OD600值调至0.5。用甲醇溶液配制INT溶液，浓度为0.01 mol/L，将150 μL的INT溶液加入1 350 μL菌悬液中使INT溶液终浓度为1 mmol/L，30 ℃孵育30 min，测定各组菌悬液的OD630值。

1.3.10呼吸链脱氢酶的测定

取培养至对数生长期的菌悬液1 mL于试管中，然后向管中依次加入2 mL的Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L，pH值8.6)、2 mL葡萄糖溶液(0.1 mol/L)和2 mL的TTC溶液(1 mg/mL)并混匀。向所得混合物中加入不同浓度的芳樟醇，设置空白组和阴性对照组，将各试管置于30 ℃、150 r/min摇床培养。分别取培养0、2、4、6、8、10 h的实验试管，向各管中加入2滴浓HCl终止反应，然后各加入5 mL正丁醇振荡萃取，待产物完全进入上层，静置后取上层液体低温离心10 min；用正丁醇调零，测定各上清液的OD490值。

1.4 数据处理

所有实验重复3次，结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行方差分析，P<0.05表示存在显著性差异；使用Origin 2018软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性分析

2.1.1芳樟醇的最小抑菌浓度分析

最小抑菌浓度(MIC)是衡量和评价物质抑菌能力的主要指标之一。实验结果表明，芳樟醇对莓实假单胞菌具有较强的抑菌作用，较低的浓度即可抑制莓实假单胞菌的生长，且抑菌效果随芳樟醇浓度的增大而增强；当芳樟醇的稀释浓度最小达到1.5 mL/L时，培养基上肉眼看不见细菌生长，因此芳樟醇对莓实假单胞菌的MIC为1.5 mL/L。未添加芳樟醇的空白组(无菌水)和阴性对照组(1%乙醇)中均有大量菌落生长，说明其对莓实假单胞菌生长未产生抑制作用或作用不明显。

2.1.2芳樟醇对莓实假单胞菌生长的影响

细菌的生长曲线可以直观反映其生长情况及生长速率。为研究芳樟醇对莓实假单胞菌生长的影响，在研究抑菌活性的基础上，测定了莓实假单胞菌的生长曲线，结果如图1。由图1可知，空白组和阴性对照组的细菌生长均呈典型的S型生长曲线，空白组经过一定时间的延滞期后，OD值显著增高，进入快速生长的对数期；阴性对照组生长略微缓慢于空白组，最终与空白组同时达到稳定期，表明1%的乙醇有一定的抑菌作用，但对细菌生长影响不大。含有1MIC和2MIC芳樟醇的实验组，生长曲线呈现显著差异，OD值基本处于低值波动，数值和增长幅度明显低于空白组和阴性对照组，说明细菌生长较为缓慢。结果表明，芳樟醇延缓了莓实假单胞菌细胞的生长周期，能有效抑制莓实假单胞菌的生长。

图1 莓实假单胞菌的生长曲线

2.2 芳樟醇对莓实假单胞菌细胞形态的影响

通过扫描电子显微镜进行形态观察，更直观地考察芳樟醇作用后莓实假单胞菌的细胞形态变化，结果如图2。由图2中(a1)、(a2)可知，空白组的莓实假单胞菌的细胞呈正常的短杆状，具有清晰的细胞边界，结构完整、形态饱满、表面光滑、分布均匀。从图2中(b1)、(b2)可知，阴性对照组的莓实假单胞菌经乙醇处理4 h和8 h后，细胞无褶皱变形，形态较为完好，未发生明显改变，大部分仍呈正常的短杆状，说明1%乙醇对莓实假单胞菌细胞形态的影响较小。相比之下，实验组的变化则较为明显，添加1MIC、2MIC的芳樟醇作用4 h后[图2(c1)、(d1)]，莓实假单胞菌的细胞形态发生较大变化，细胞边界变得模糊，细胞出现扭曲变形和堆叠黏连，部分细胞出现空洞干瘪；芳樟醇作用8 h后[图2(c2)、(d2)]，莓实假单胞菌的细胞形态受到严重破坏，菌体发生凹陷，细胞畸变增加，出现明显的细胞破裂和黏合现象，基本没有形态正常的细胞；添加2MIC芳樟醇的细胞形态影响更为显著，细胞破损黏合成团，完全失去其原有形态。细胞形态的改变可能是因为芳樟醇破坏了细菌的细胞膜，引起胞内物质外泄所致。本研究结果表明，芳樟醇能够破坏莓实假单胞菌细胞的结构形态，从而抑制细菌的生长。

图2 莓实假单胞菌的扫描电镜图

2.3 芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜的影响

细胞膜能保护胞内物质和能量的平衡，从而使细胞维持正常的生命活动。研究表明，抑菌物质一般通过作用于细胞膜而对细菌产生抑制作用，因此可通过考察芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜的影响，来揭示其抑菌作用机制。

2.3.1结晶紫染色结果分析

结晶紫是一种疏水染料，完整的细胞膜可抑制结晶紫进入细胞；但当细胞膜受损时，膜的通透性增大，结晶紫可进入细胞内，细胞膜吸收结晶紫而被染色。本研究采用结晶紫染色法考察细菌细胞膜的损伤，进而探讨芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜的作用机制。不同培养时间莓实假单胞菌对结晶紫的吸收情况(OD590值变化情况)如图3。由图3可知，随着培养时间的延长，空白组、阴性对照组、1MIC和2MIC实验组的OD值均降低，说明8h时细胞对结晶紫的吸收程度低于4 h时。在两个测定时间点，加入芳樟醇处理的实验组OD值明显高于空白组和阴性对照组，说明芳樟醇可促进细胞对结晶紫的吸收，使得590nm处的OD值较未处理组增大。结晶紫染色实验结果表明，芳樟醇作用可导致细胞膜受损，从而增加细胞膜的通透性，增强其对结晶紫的吸收。

不同小写字母表示组间差异显著。

2.3.2二乙酸荧光素染色结果分析

二乙酸荧光素(FDA)是一种脂质分子，不带荧光和电荷，容易通过细胞膜，在细胞中被酶水解为荧光素。采用FDA染色方法，通过测定菌悬液的荧光强度，判断细胞膜是否被破坏，进一步验证细菌细胞膜的损伤。不同培养时间莓实假单胞菌的FDA荧光强度变化情况如图4。由图4可知，空白组和阴性对照组的荧光强度随培养时间呈现缓慢上升的趋势，说明荧光素留在了细胞内并发出黄绿色荧光，此时细胞结构较为完整，通透性变化小；而芳樟醇处理的实验组的荧光强度随时间呈现明显下降趋势，2MIC组的荧光强度比1MIC组降低更多，荧光素的泄漏导致了荧光强度的降低，说明细胞膜结构被破坏，细胞膜通透性增强，导致FDA外泄。FDA染色实验结果表明，芳樟醇作用能破坏细胞膜的完整性，随着芳樟醇浓度的增加和作用时间的延长，细胞膜的受损程度更加明显。

不同小写字母表示组间差异显著。

2.3.3对菌悬液电导率的影响

电导率变化是判断细菌细胞结构变化的一个重要依据。通过测定不同培养时间菌悬液的电导率大小及变化情况，研究芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜的影响，实验结果如图5。由图5可知，与空白组和阴性对照组相比，用芳樟醇处理的两个实验组的电导率均偏高。在正常生命活动中，细胞内外的离子在细胞膜屏障下，会维持动态平衡，膜外环境的电导率基本不变。在抑菌物质芳樟醇的作用下，莓实假单胞菌的细胞膜受损，失去保护能力和屏障作用，使原本细胞内容物中的带电离子(如K+、Na+、Ca2+、Mg2+等)泄漏到细胞膜外，内部电解质外泄，导致膜外环境的电导率升高。本研究结果表明，芳樟醇可通过损伤细胞膜，增加细胞膜的通透性，从而抑制细菌的生长。

图5 芳樟醇对莓实假单胞菌电导率的影响

2.3.4对核酸泄漏的影响

核酸具有编码合成蛋白质的功能，在细胞的生命活动中发挥着重要作用，如果胞内核酸丢失，将会导致细胞死亡。不同培养时间细胞外的核酸泄漏情况如图6。

图6 芳樟醇对莓实假单胞菌核酸泄漏的影响

由图6可知，各组的OD值均随时间呈上升趋势，在测定时间点，芳樟醇处理的实验组OD值均高于空白组和阴性对照组。实验组OD值在0～2 h时增长最快，之后增长速度放缓，说明芳樟醇破坏了莓实假单胞菌的细胞膜，导致细胞内核酸不断从细胞膜内流出，在0～2 h时破坏作用最明显。本研究结果表明，芳樟醇不仅破坏了细胞的结构，也导致了胞内遗传物质的泄漏，从而影响细胞的正常生理活动。这与郭俸钰等[11]研究的芳樟醇对大肠杆菌的核酸泄漏影响结果相一致。

2.4 芳樟醇对莓实假单胞菌呼吸代谢的影响

2.4.1对呼吸代谢活力的影响

活细胞在脱氢酶的作用下生成的活化氢离子能把碘硝基氯化四氮唑蓝(INT)还原成紫红色的INT甲臜，沉积在细胞中。根据INT甲臜的生成情况，可考察细胞的代谢活力强弱。不同培养时间的细胞呼吸代谢活力变化情况如图7。由图7可知，空白组细胞的呼吸代谢活力基本维持不变；阴性对照组的呼吸代谢活力略低于空白组，且处于一个较高的水平，说明乙醇对细胞呼吸代谢活力的影响较小；相比空白组和阴性对照组，芳樟醇处理的实验组OD值明显较低，还原出来的INT甲臜的量较少，说明实验组细胞的呼吸代谢活力被抑制，细胞代谢活力较弱，生成的活化氢离子较少。本研究结果表明，芳樟醇对莓实假单胞菌的呼吸代谢活力有较大影响。

图7 芳樟醇对莓实假单胞菌呼吸代谢活力的影响

2.4.2对呼吸链脱氢酶活性的影响

呼吸链负责通过氧化还原反应将电子从电子供体转移到电子受体，是维持细胞正常代谢的能量来源。TTC是一种小分子无色化合物，可渗透到细菌细胞中，与呼吸链脱氢酶发生反应，被还原成红色的1,3,5-三苯甲臜(TF)。可根据TF的生成情况，来考察细胞的呼吸链脱氢酶活性强弱。不同培养时间的呼吸链脱氢酶活性的变化情况如图8。

图8 芳樟醇对莓实假单胞菌呼吸链脱氢酶活性的影响

由图8可知，随着培养时间的延长，空白组和阴性对照组的OD值先升高，6 h时达到最大值，然后开始降低，这可能是因为培养6 h后细胞逐渐衰老，呼吸链脱氢酶的活性有所减弱；培养过程中，空白组和阴性对照组的OD值相差不大，说明乙醇对莓实假单胞菌呼吸链脱氢酶活性的影响较小。芳樟醇处理的实验组OD值均明显低于空白组和阴性对照组，说明实验组细菌的呼吸链脱氢酶活性均较低，电子释放较少，还原过程被抑制，导致生成TF的量较少。本研究结果表明，芳樟醇对莓实假单胞菌的呼吸链脱氢酶活性有较强的抑制作用。细菌的呼吸链位于细胞膜上，芳樟醇可能破坏了细胞膜屏障，抑制了呼吸链脱氢酶的活性，对呼吸链造成损伤，进而影响了细胞呼吸代谢。

3 结 论

本文研究了芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及作用机制，结果表明：芳樟醇对莓实假单胞菌具有较强的抑制作用，其最小抑菌浓度为1.5 mL/L；芳樟醇能破坏莓实假单胞菌细胞膜的完整性，增加细胞膜的通透性，导致胞内物质向外泄漏；芳樟醇抑制呼吸链脱氢酶活性，破坏呼吸链，引起细胞呼吸代谢活力降低，从而导致胞内代谢紊乱，抑制菌体生长。本研究表明，芳樟醇具有较好的抑菌活性，能够通过破坏莓实假单胞菌细胞原有的正常形态结构和抑制莓实假单胞菌的呼吸代谢而发挥抑菌作用。目前对于芳樟醇抑菌机理的研究主要为基于细胞水平的初步探究，未来可采用基于蛋白质组学、代谢组学、转录组学以及多组学联合分析的方法，从分子层面开展深入研究，进一步阐明芳樟醇的抑菌机理。