蟹类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展

刘光明， 刘庆梅， 杨 阳， 刘 萌， 李梦思， 桓 霏， 郜 帅， 曹敏杰

(集美大学 海洋食品与生物工程学院/水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心/厦门市海洋功能食品重点实验室, 福建 厦门 361021)

引起机体过敏反应的原因众多，其中由食物引发的过敏反应发病率不容忽视[1]，食物过敏也已被世界卫生组织列为21世纪重要的健康问题之一[2]。西方国家过敏人群的过敏食物以花生及坚果类为主，而东方国家多为鱼类及甲壳类水产品[3]。2020年，我国甲壳类水产品总产量为603.3万t；相较于2019年，其增长率为6.32%[4]；随着年产量及消费量的增加，食用甲壳类水产品引起的过敏问题也呈增加的趋势。蟹类是重要的甲壳类水产品，其诱发的过敏反应是由免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E介导的速发型超敏反应，通常会持续终生[5]。我国香港地区的调查结果显示，在459名过敏患者中，对蟹类、虾类和贝类的过敏患病率分别为15.3%、13.9%和11.1%[6]。因此，蟹类引起的过敏反应不容忽视。

食物过敏原是指能够诱导机体产生特异性IgE抗体并与之结合，进一步激活机体免疫系统，从而引发过敏症状的食物特定成分。目前经由世界卫生组织/国际免疫学会联合会(World Health Organization/International Union of Immunological Societies，WHO/IUIS)过敏原命名小组鉴定的超过125个物种的370种食物过敏原，90%以上为蛋白质[7]，其中已被命名的蟹类过敏原共9个。在过敏原分子中决定特异性的特殊化学基团称为抗原表位，可被抗体或免疫受体识别[8]。目前，蟹类过敏原(如原肌球蛋白、精氨酸激酶等)的抗原表位已逐渐被定位分析。此外，多项研究表明：不同处理技术主要通过改变过敏原的结构，修饰、破坏或掩盖过敏原的表位，从而达到消减过敏原致敏性的目的[9-10]。我国蟹类过敏的发生率较高，如何消减蟹类致敏性、促进蟹类产业持续健康发展已成为一个亟需解决的重要问题。本文介绍了蟹类水产品过敏原及过敏原表位，详细对比了用于消减蟹类水产品致敏性的不同处理技术，以期为蟹类低致敏食品及低致敏性生物制品的开发提供参考。

1 蟹类水产品过敏原及过敏原表位

过敏原对热、pH值和胃肠道消化酶具有高度耐受能力，从而保留完整的表位序列和结构，可被过敏原特异性免疫细胞识别，引发特异性免疫反应，导致过敏症状[11]。随着蛋白质鉴定技术的进步，目前已有多种蟹类过敏原被报道，其中原肌球蛋白(tropomyosin，TM)与精氨酸激酶(arginine kinase，AK)是主要过敏原，其他次要过敏原，如肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP)等也备受关注[12]。

1.1 原肌球蛋白

TM由多种肌动蛋白结合蛋白组成，主要功能是调节肌动蛋白细胞骨架[13]。1998年，在锈斑蟳(Charybdisferiatus)中TM被鉴定为过敏原，并获批WHO/IUIS系统命名为Cha f 1[14]。此后TM也相继在帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)、青蟹(Scyllaparamamosain)、梭子蟹(Portunuspelagicus)和雪蟹(Chionoecetesopilio)等蟹类中被发现，序列同源性均高达95%以上[15-16]。TM致敏率在23%～83%，分子质量为34～38 kDa，氨基酸长度由284个氨基酸残基组成，是等电点约为4.5的糖蛋白，耐热耐酸碱，且具有良好的消化稳定性(耐胃蛋白酶和胰蛋白酶消化)[6]。其空间结构由两条α-螺旋相互缠绕而成，增加了蛋白结构稳定性，使其经高温高压处理后仍能保持较强的致敏性[17]。在蟹类TM的过敏原表位分析中，有研究采用消化酶水解结合质谱分析获得青蟹TM的7条耐热耐消化的线性表位[18]。此外，Liu等[19]以兔抗青蟹TM多克隆抗体为靶蛋白，通过噬菌体展示技术淘选获得青蟹TM的8条IgG线性表位与7个IgG构象表位。

1.2 精氨酸激酶

AK的生理功能主要是参与细胞ATP水平的调节，它可催化甲壳类动物中L-精氨酸残基的磷酸化，这是细胞能量稳态机制的关键反应[20]。过敏原AK已在雪蟹[21]、梭子蟹[22]、青蟹[23]、褐蟹(Callinectesbellicosus)[24]等蟹类中被鉴定，分子质量为40～42 kDa，一般由359个氨基酸残基组成，等电点约6.0，胰酶消化240 min后仍维持原有蛋白条带，但不耐胃蛋白酶消化。目前，青蟹AK的晶体结构已被解析，其是由α螺旋的N端区域与α螺旋-β折叠的C端区域缠绕成的不对称结构[23]。与TM相比，AK不稳定、不耐热，且易挥发，因此也被认为是吸入蒸汽引起呼吸道过敏症状的过敏原之一[25]。Yang等[26]以蟹类过敏患者血清中特异性IgE为靶蛋白，通过噬菌体展示技术获得青蟹AK的5条线性表位与8个构象表位。利用BediPred和Discotope进行褐蟹AK的表位预测分析，得到8条潜在的线性表位和7个潜在的构象表位，其中2条线性表位(K40-S45、S130-F136)及2个构象表位(D106N108、E317E319G320)与青蟹AK的表位重叠[24]。

1.3 肌质钙结合蛋白

属于钙离子结合蛋白家族的SCP在肌肉松弛方面发挥重要作用，空间结构包含螺旋- 环- 螺旋基序以结合钙离子，已在雪蟹[24]、青蟹[27]中被鉴定为过敏原。其分子质量约为20 kDa，包含194个氨基酸，等电点为4.7，在高温(60～100 ℃)、弱酸(pH值2.0～5.0)、强碱(pH值10.0～11.0)条件下均易发生聚合，且不耐胃蛋白酶消化。Chen等[28]通过生物信息学软件预测结合血清学实验确定了青蟹SCP的3条线性表位，Yang等[26]采用噬菌体展示技术获得青蟹SCP的6个构象表位。

1.4 其他过敏原

除了上述3种过敏原，其他一些蟹类过敏原也受到研究关注：Li等[29]鉴定了青蟹中分子质量为18 kDa的肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)，获批WHO/IUIS系统命名为Scy p 3，其对热稳定，包含153个氨基酸残基，三级结构由8个α-螺旋紧密缠绕而成，并利用生物信息学技术结合血清学实验确定MLC的7条线性表位；Yang等[26]纯化获得了青蟹过敏原磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase，TIM)和细丝蛋白c(filamin c，FLN c)，分子质量分别为28 kDa和90 kDa，均不耐热。TIM的晶体结构呈现二聚体且单体为(β/α)8筒状[30]，FLN c中过敏优势区(336～531个氨基酸位置)的晶体结构是由16条β-折叠和2条α-螺旋组成的筒状[31]。通过噬菌体展示技术获得TIM的4条线性表位与4个构象表位、FLN c的6条线性表位与6个构象表位，且TIM和FLN c由于相同表位基序PLRG、P(T/K)VH(I/T)L、MQP和L- TT- GA的存在，使得二者能够被相同的抗体识别结合[26]。血蓝蛋白(hemocyanin，Hc)已在中华绒螯蟹中被鉴定，其存在3条与血清IgE结合频率大于40%的重要线性表位[32]。

由研究报道可知，已鉴定的蟹类水产品过敏原及其详细的表位信息见表1。

表1 蟹类水产品过敏原及过敏原表位

2 蟹类水产品致敏性的消减技术

基于鉴定的过敏原及其表位，选择有效的处理方式定向消减蟹类致敏性以生产低致敏产品，已逐渐成为该领域发展的一个新趋势。迄今为止，致敏性消减主要可分为物理法、化学法、生物法3大类，物理法包括热处理、辐照、超声技术等，化学法包括美拉德反应等，生物法包括酶法交联、酶解技术、微生物发酵和分子改造等[2, 10]。

2.1 物理消减技术

2.1.1热处理消减

热处理是最常用的加工方法，包括煮制、蒸制、高压蒸汽等，主要借助高温影响过敏原的空间结构、消化性和抗原表位等，以改变过敏原的致敏性。Yu等[33]发现煮制对TM的消化稳定性影响不大，高压蒸汽通过降低青蟹TM的消化稳定性而达到消减青蟹致敏性的效果。Liu等[34]比较了蒸制、煮制和高压对拟穴青蟹肌肉组织的影响，结果显示高压处理通过减少青蟹肌肉组织中的过敏原含量和种类、破坏蛋白空间结构，从而有效降低了青蟹肌肉粗蛋白的致敏性。但由于热处理方式和蟹肉中各个过敏原耐热性的不同，使得热处理在降低蟹肉致敏性的研究结果中存在差异[35]，因此，利用该方法有效消减蟹肉的致敏性还有待进一步深入。

2.1.2辐照消减

利用射线对食物进行辐照，通过产生电离和激发而释放出轨道电子并形成自由基，使之与食物中的蛋白质发生一系列物理、化学、生物化学反应，降低蛋白质的稳定性，导致蛋白质的降解、聚合、交联、改性等[36]。笔者研究团队利用辐照技术处理了中华绒鳌蟹和三疣梭子蟹的TM，结果显示低辐照剂量(3～7 kGy)对TM致敏性无影响，当辐照剂量提高至10 kGy时明显破坏了TM结构完整性，有助于其消化性的升高和致敏性的降低[37]。同样地，张明琦等[38]发现随着辐射剂量的增加，蟹粗提液的蛋白浓度下降、疏水性升高、与抗体的结合能力减弱，结果表明辐照能够改变蟹过敏原的溶解度、空间结构、掩盖或破坏过敏原的抗原表位，从而有效消减其致敏性。

2.1.3超声消减

超声波是一种机械波，在传播过程中与媒介相互作用，可以形成高速率、高剪切力的微小漩涡，诱导基质的空化效应，产生自由基，从而引起蛋白质结构的改变[39]。超声处理可以引起食物组织的微观结构破坏、总蛋白的溶解度显著降低，导致过敏原的结构发生变化、体外消化率显著提高，从而影响食物的致敏性[40]。程华峰等[41]发现普通蒸煮对中华绒螯蟹肌肉粗蛋白的致敏性无影响，超声结合蒸煮处理能促进粗蛋白中TM的降解，并降低其致敏性。此外，有研究表明：微波处理后青蟹肌肉粗提物中TM的消化稳定性及致敏性没有明显变化，而超声处理(200 W、30 ℃)、超声结合蒸煮处理均能使青蟹TM快速消化从而降低蟹肉的致敏性，其中超声结合蒸煮处理的效果更显著[42]。

2.2 化学消减技术

蟹类水产品致敏性的化学消减技术是通过美拉德反应完成。美拉德反应是利用食物中的游离氨基或者氨基酸残基与还原糖(果糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)的羰基在一定温度下发生非酶褐变的反应[43]。迄今为止，美拉德反应消减食物过敏原致敏性的研究越来越多，其主要机理在于还原糖通过修饰过敏原的关键位点来降低其与特异性抗体的结合，以达到食物减敏或脱敏的效果[44]。Han等[45]将拟穴青蟹TM、AK与L-阿拉伯糖反应后，由于过敏原的表位发生糖化修饰而被掩盖、破坏，使得TM美拉德反应产物的脱颗粒能力降低了12.5%，AK美拉德反应产物的脱颗粒能力降低了30.0%。拟穴青蟹SCP与木糖发生美拉德反应后，二级结构发生改变，且糖化修饰产生的糖链对过敏原表位形成封闭作用，使其能够显著下调过敏患者嗜碱性粒细胞表面CD63分子的表达，阳性细胞下降比例为20.44%～90.83%，最终有效消减了SCP的致敏性[27]。

2.3 生物消减技术

2.3.1酶法交联消减

在温和的反应条件下，交联酶(漆酶、谷氨酰胺转移酶、酪氨酸酶、过氧化物酶等)可以通过分子内或分子间共价键诱导蛋白质交联，进而影响蛋白质的空间构象[46]。目前，酶与过敏原的交联在降低食物过敏原致敏性方面显示出广阔的前景。酪氨酸酶和辣根过氧化物酶均能与拟穴青蟹TM发生交联，产生的大分子物质的疏水性明显变化、致敏性显著降低，并在一定程度上诱导小鼠出现耐受[47]。Fei等[48]发现在咖啡酸和酪氨酸酶催化下与拟穴青蟹AK有效交联，交联产物耐胃蛋白酶消化、二级结构发生变化，且由于抗原表位被覆盖而降低肥大细胞脱颗粒和释放组胺的能力，并在小鼠体内显示致敏性降低。

2.3.2酶解消减

酶解技术作为一种高效、安全、环保的传统食品加工方法应用于食品工业，蛋白酶可水解断裂过敏原的肽键来破坏其空间结构和线性表位，以达到降低过敏原致敏性的目的[49]。有研究发现在3种蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及蛋白酶P)的消化作用下，北海道毛蟹和雪蟹提取物的致敏性几乎完全丧失[50]。同样地，Yu等[51]利用胃蛋白酶处理拟穴青蟹AK，酶解产物的IgE结合能力明显降低，提示AK消化产物的IgE结合位点可能在消化过程中被部分或全部破坏，从而减弱了与血清IgE抗体的反应能力。酶解技术能够有效消减过敏原的致敏性，但仍受到酶的种类、酶解模式、酶解程度等因素的影响。

2.3.3微生物发酵消减

发酵法是生物技术中最早发展和应用的食品加工技术之一，利用微生物的代谢活动，通过生物催化剂(微生物细胞或酶)将有机物质转化成产品的过程[52]。有研究利用发酵技术消减小龙虾及鱼类致敏性的同时，还能保持水产品的营养[53-54]。同时，赵丹丹等[55]通过乳酸菌和酵母菌混合发酵大闸蟹，获得了低致敏性的蟹肉，且产品具有良好的口感与风味。由于微生物的参与，在发酵过程中需要优化多种条件，以获得期望的效果。但不同食品发酵所需的菌株及时间等条件的差异，制约了该方法在食品加工中的广泛应用。

2.3.4分子改造消减

分子改造技术已逐渐成为获得理想蛋白质的常用方法，对诱发免疫反应的抗原表位进行表位删除、突变等，能够有效降低过敏原的IgE结合能力和致敏性。Liu等[19]利用定点突变技术突变青蟹TM抗原表位上的关键氨基酸，显著降低了TM的IgE结合能力。Xia等[30]将青蟹TIM构象表位上的关键氨基酸突变为丙氨酸，获得了低致敏性突变体。对青蟹SCP构象表位关键氨基酸及钙离子结合位点进行替换，有效消减了SCP的致敏性[56]。此外，Li等[57]通过敲除青蟹TM、MLC耐热耐消化的线性表位构建了2种突变衍生物，与野生型过敏原相比，该类衍生物表现出显著降低的IgE结合能力和致敏性。

当前对于蟹类水产品致敏性消减技术的研究中，物理法、化学法及生物法中的酶法交联、酶解法研究较多，而生物法中的微生物发酵、分子改造尚处于起步阶段。蟹类水产品致敏性消减处理技术的对比分析见表2。

3 总结与展望

迄今为止，已有多种蟹类中的过敏原被鉴定、抗原表位被定位，同时，物理法、化学法、生物法均能够改变蟹肉中过敏原的结构、并对其抗原表位进行修饰、破坏或掩盖等，从而有效消减了蟹肉的致敏性。虽然不同处理方式在蟹类致敏性消减方面取得了一定的进展，但仍然存在一些问题有待深入：1)蟹类水产食物中复杂的基质对加工效果存在影响，因此蟹类水产品过敏原结构与致敏性的构效关系解析是该领域的研究难点。2)实验室研发与工业化生产之间存在多种技术衔接问题，目前难以实现低致敏性蟹类食品的大规模量产，对于当前效果明显的消减处理方式亟须进行工业化中试。3)单一的加工技术难以同时消减蟹肉中多个过敏原的致敏性，现有蟹类产品的工业化生产大多涉及热处理，利用多种加工方法联合处理进行探究，例如将热处理与超声技术或美拉德反应技术或酶法处理技术等联用有望更大程度地降低其致敏性，以促进蟹类产业的持续健康发展。