过表达Beclin1可促进黑色素瘤A375细胞的自噬并抑制其上皮间质转化

韩昭， 高艳玲， 张建忠， 张伶， 徐艳艳， 李小静

1.河北工程大学附属医院皮肤科，2.邯郸市中心医院急诊科，河北 邯郸 056002

恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是一种恶性度极高的肿瘤，发病率和死亡率逐年增高。本病进展快，一旦确诊,多属于晚期，我国每年新增的黑色素瘤患者显著增加[1]，且目前本病发病机制尚不明确，治疗手段局限。自噬在机体的病理和生理过程中十分常见，其对于维持细胞的稳定具有重要作用[2]。自噬活动及其相关基因的表达与肿瘤的发生发展有着密切关系，细胞自噬和生物学行为通过分子调控机制相互协调转化。Beclin1蛋白是调控自噬的关键标志蛋白,在自噬体形成早期发挥重要作用[3]。目前已有多项研究证实，Beclin1基因与多种恶性肿瘤有着复杂的关联，如肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等[4]。前期研究结果显示，Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞的生长增殖及侵袭转移等生物学行为起到抑制作用[5]。上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胚胎发育过程中正常的生理过程，在肿瘤的发生发展过程中同样扮演着重要角色。已有研究显示，MM的发病与其EMT过程有密切关系[6]。本研究应用裸鼠皮下异种移植瘤模型，进一步观察Beclin1的过表达对黑色素瘤自噬水平及EMT过程的影响，以期为今后Beclin1基因用于人黑素瘤的基因治疗提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂

BABLc裸鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；黑色素瘤细胞系A375购自中国科学院上海生物科学研究所。兔抗人单克隆抗体Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin均购自美国Abcam公司；DMEM高糖培养基购自上海世丰生物技术有限公司；10%胎牛血清及青链霉素购自美国Hyclone公司；Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn PCR引物的设计及合成由Thermo Fisher公司完成；lipofectamin 2000购自美国Invitrogen公司；Trizol提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；cDNA合成试剂盒购自中国Takara公司；Real time PCR Master Mix(SYBR Green)购自中国Takara公司；Western blotting检测试剂盒购自中国江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 主要仪器

CO2培养箱产自日本SANYO公司；超净工作台产自中国苏州净化公司；生物倒置显微镜产自日本OLYMPUS公司；紫外光度仪产自美国Thermo公司；荧光定量PCR循环仪产自美国ABI公司；Western 电泳仪产自美国BIO-RAD；移液器产自德国eppendorf公司；紫外光度仪产自日本SHIMADZU公司。

1.3 细胞培养及分组转染

黑色素瘤A375细胞培养于含10%胎牛血清和双抗(青霉素：100 U/mL;链霉素：100 mg/mL)的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱恒温恒湿培养。隔天换液，细胞融合度达75%时传代，细胞传代3次达稳定状态后取细胞悬液培养至密度达到50%～70%时进行质粒转染，质粒的构建由上海汉恒生物科技有限公司完成。将细胞分为空白组、NC组、转染组，空白组只转染试剂，NC组转染空质粒，转染组转染携带目的基因的质粒。转染试剂盒室温平衡20 min，依照试剂盒说明，采用LipofecamineTM2000对A375细胞按照上述分组转染48 h后收集细胞，进行后续实验。

1.4 转染细胞裸鼠皮下移植实验

4～5周龄SPF级BABLc裸鼠18只，雌性，分3组，每组6只。分别收集空白组、NC组、转染组培养的转染细胞悬液，浓度为1×107个/mL，分别以每只0.1 mL接种于3组裸鼠右侧腋窝皮下。每天观察接种后裸鼠活动及成瘤情况。以皮下结节长径超过0.5 cm为成瘤标准，计算成瘤率。成瘤后隔日用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，连续测量21 d。根据公式计算肿瘤的体积[7]，绘制生长曲线。肿瘤体积(V)=0.5×L×W2。21 d后处死裸鼠，手术剥取肿瘤进行后续实验。

1.5 RT-PCR检测各基因mRNA的表达

Trizol法提取各组肿瘤组织中的总RNA,测定RNA浓度及纯度，各样本取5 μL总RNA按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成，取2 μL合成产物设置PCR 扩增程序进行反应，按照一定的顺序加入0.1 mL PCR管，一个样本基因做3个复孔。用SYBR PCR Master Mix对Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirnmRNA表达水平进行检测，内参基因选择GAPDH。各基因上下游引物(表1)的设计及合成由Thermo Fisher公司完成。Real time-PCR扩增体系为20 μL，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环40次。实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比,目标基因的相对定量用2-ΔΔCT计算,ΔΔCt=(Ct实验-Ct参比)-(Ct对照-Ct参比),Ct为根据扩增曲线确定的扩增循环数。每组实验重复3次，取平均值。

表1 各基因的上游引物及下游引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 Western blotting检测各基因蛋白表达

用RIPA试剂盒提取各组肿瘤组织中总蛋白，用BCA法测定蛋白质含量。蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转入NC膜，室温下用5%的BSA封闭，分别加入相应浓度稀释的单克隆抗体，1 ∶3 000稀释的GAPDH为内参标准，孵育过夜，用PBS洗涤5次，每次5 min。加入1 ∶5 000鸡抗兔IgG二抗，温育1.5 h，用TBST清洗4次，每次10 min。化学发光，显影，定影。使用G:BOX-chemiXR5成像，采用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析，将各基因和GAPDH比值作为蛋白相对表达水平。每组实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学处理

所有统计数据使用SPSS 21.0软件进行分析。数据用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较使用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1过表达对A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤生长的影响

经5～7 d成瘤潜伏期，3组裸鼠右侧腋窝皮下接种部位均可见直径大于0.5 cm的肿瘤团块。移植瘤外观似球形或结节状，质地略软，张力较大，随着时间的延长，肿瘤体积逐渐增大，质地变硬(图1)。实验结束时，3组裸鼠右侧腋窝皮下接种部位可见直径0.8 cm～1.8 cm的肿瘤团块(图2)，3组成瘤率均为100%,均未见死亡病例。异种移植瘤的生长情况：在成瘤后5 d内，3组肿瘤细胞生长速度大致相当，差异无统计学意义。成瘤第5天起，转染组肿瘤生长速度低于空白组和NC组，组间差异具有统计学意义(F=21.04，P=0.013)，而空白组和NC组之间差异无统计学意义(t=1.52,P>0.05)。

图1 3组裸鼠皮下异种移植瘤的生长情况Figure 1 Growth of subcutaneous xenograft tumors in the three groups of nude mice.

图2 成瘤21 d后3组裸鼠皮下异种移植瘤Figure 2 Size of subcutaneous xenograft tumors in the three groups of nude mice after 21 days of tumor formation.

2.2 RT-PCR检测各基因mRNA的表达

RT-PCR结果显示(表2)，空白组与NC组比较,各基因mRNA的表达无明显差异(P>0.05)；而相对于空白组与NC组，转染组Beclin1、LC3和E-cadherin的mRNA表达均升高(P<0.05)，Vimentin和N-cadherin的mRNA表达均降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。

表2 各组肿瘤组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn的mRNA表达Table 2 Expression levels of mRNA for Beclin1, LC3Ⅱ, Vimentin, N-cadherin and E-cadheirn in tumor tissues

2.3 Western blotting检测各基因蛋白表达

Western blotting结果显示(图3、表3)，空白组与NC组比较,各基因蛋白的表达无明显差异(P>0.05)；而相对于空白组与NC组，转染组Beclin1、LC3Ⅱ和E-cadherin蛋白表达均升高，Vimentin和N-cadherin蛋白表达均降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表3 Western blotting检测各组肿瘤组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin、E-cadheirn蛋白相对表达量Table 3 Relative expression levels of Beclin1, LC3Ⅱ, Vimentin, N-cadherin, E-cadheirn proteins in tumor tissues assessed by Western blotting

图3 Western blotting检测各组肿瘤组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn的蛋白表达Figure 3 Expression levels of Beclin1, LC3Ⅱ, Vimentin, N-cadherin and E-cadheirn proteins in each group of tumor tissues assessed by Western blotting.

3 讨论

自噬是一种广泛存在于真核生物中的代谢过程。近年来研究认为，自噬在黑素调节中亦起着重要的作用，自噬激活剂通过激活自噬-溶酶体途径诱导黑素小体自噬降解，过表达Beclin1、 LC3Ⅱ可能通过诱导自噬促进黑素合成。近年来自噬对于黑素累积或减少的具体作用机制正处在研究阶段。自噬与肿瘤之间的关系复杂，自噬究竟是促进还是抑制肿瘤的发生发展也尚未定论[8]。Beclin1基因是酵母Atg6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。定位于胞质内质网上的Beclin1是诱导肿瘤细胞走向自噬性死亡的重要因子。已有研究证实，通过上调Beclin1在结肠癌以及宫颈癌体外细胞中的表达，可使生长周期停滞从而抑制细胞增殖[9]。黑色素瘤中Beclin1的表达与肿瘤的进展呈负相关，且与预后因素有关[10]。本课题组以往的研究结果显示：黑色素瘤SK-MEL-2细胞株Beclin1蛋白明显低表达，Beclin1表达上调后可显著抑制SK-MEL-2细胞的增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为[5]。本实验结果显示，与空白组和NC组相比，转染组皮下移植瘤生长速度缓慢;21 d后，肿瘤的体积及重量均明显低于空白组和NC组(P<0.05)。表明过表达Beclin1可明显抑制A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤的生长增殖。

微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associaled protein 1 light chain 3，LC3)是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，同样是特异性自噬性标志蛋白，并在自噬体的形成中发挥重要的作用[11]。自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ在非小细胞肺癌及宫颈病变中起协同抑癌作用[12-13]。本实验从基因及蛋白水平也证实过表达的Beclin1可以促进LC3的表达，二者在黑色素瘤的表达呈正相关，提示Beclin1和LC3活性下降或缺失可能参与黑色素瘤的进展。

正常组织和肿瘤组织中都存在上皮间质转化现象，上皮细胞逐渐失去细胞粘附、紧密连接等表型并获得间质细胞无极性、可迁移性等表型的过程即为上皮间质转化EMT[14]。上皮与间质细胞在分子水平也各自表达特有的标志物，如E-cadherin主要表达于上皮细胞，N-cadherin和Vimentin等分子主要表达于间质细胞。EMT能使肿瘤细胞获得更高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力，进而促进肿瘤的侵袭转移[15]。非小细胞肺癌组织中E-cadherin低表达和Vimentin高表达在肿瘤的侵袭和转移过程中起到了重要的调控作用，是细胞恶性转化的一个特征[16]。自噬可通过肿瘤细胞表型调节细胞迁移和侵袭[17]。上皮间质转化在肿瘤转移中起重要作用。早期研究表明，自噬与EMT相互联系，在肿瘤转移过程中EMT激活的癌细胞具有高水平的自噬，在多种应激条件下存活[18]。自噬基因Beclin1可能以不同的分子机制在肿瘤上皮-间充质转化侵袭转移过程中发挥着“双重作用”。一方面，细胞在EMT过程中依赖自噬激活生存，另一方面，自噬起到抑制肿瘤信号的作用，阻碍了转移的早期阶段和EMT的激活。因此，通过靶向自噬来调节EMT是治疗恶性肿瘤的一种非常有前途的策略[19-20]。焦庆丽等[21]发现在乳腺癌组织中的Beclin1蛋白水平明显低于正常乳腺组织，且低表达的Beclin1可使E-cadherin表达下调而 N-cadherin 表达上调的 EMT 现象增加，促使乳腺癌的恶性程度增加;进一步通过对乳腺癌细胞系的研究发现，稳定转染Beclin1可降低甚至逆转其EMT过程。本研究采用RT-PCR实验和Western blotting实验分别从基因水平和蛋白水平检测Beclin1对黑色素瘤EMT过程的影响,结果显示，相对于空白组与NC组，转染组E-cadherin mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05)，Vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05),证实Beclin1的过表达抑制了黑色素瘤EMT的过程，可能进而影响肿瘤的恶性生物学行为。

综上所述，本研究在动物模型中验证了Beclin1的过表达可促进小鼠黑色素瘤发生自噬，并抑制肿瘤的生长增殖及EMT过程,Beclin1可能成为治疗黑色素瘤的新靶点。但是，本研究未在黑素瘤患者标本中检测Beclin1蛋白的表达情况，现阶段关于Beclin1调控自噬对黑色素瘤的具体调控机制亦未完全清楚，以后尚需进一步全面深入地研究Beclin1在黑色素瘤治疗中的作用，以期为研发黑色素瘤的治疗药物提供新的方向。