间充质干细胞通过抑制TYK2磷酸化缓解小鼠银屑病样皮炎的皮损病变

梁丽娜, 骆青燕, 王欢, 吉苏云

南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091

银屑病(psoriasis)的发病与遗传背景、环境诱因、免疫应答异常等因素有关[1]，其中IL-23/Th17轴被认为在银屑病的发生发展中有着重要作用[2]。Janus激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)途径是一种重要的细胞因子信号转导途径[3]。TYK2作为JAK家族成员之一，介导IL-23诱导Th17细胞的增殖、活化，促使IL-17、IL-22、IL-23等细胞因子表达增加，与银屑病的发病机制有关[1]。既往研究报道TYK2抑制剂可显著抑制银屑病样皮炎小鼠的皮肤炎症和细胞因子的产生[4]，目前Ⅱ期临床研究结果也显示口服选择性TYK2抑制剂对中重度银屑病有着良好的治疗效果[5]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种免疫原性低、自我更新能力强、免疫调节特性强的成体多能祖细胞，因具有调节B、T细胞增殖、抑制树突状细胞成熟、抑制中性粒细胞动员等免疫调节功能，被认为是治疗克罗恩病、系统性红斑狼疮等多种自身免疫或炎症性疾病的一种治疗方式[6-8]。有报道2例寻常型银屑病患者在接受MSCs治疗后疗效明显，且观察4～5年均无复发[9]。但目前MSCs治疗银屑病的详细机制尚未清楚，对TYK2的作用亦不清楚。因此，本研究探讨MSCs对银屑病样皮炎小鼠TYK2的磷酸化影响，为MSCs治疗银屑病的机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞

MSCs来源于中山大学附属第三医院刘秋莉老师赠与的人脐血来源的第4代MSCs。BALB/C雌性小鼠，共9只，6～8周龄，购于广东省医学实验动物中心。研究经本院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 MSCs培养 在37 ℃、5% CO2标准细胞培养箱中，用10% FBS(Gibco)、1%双抗(Gibco)的低糖DMEM培养基(Gibco)中培养MSCs，取第5～8代的MSCs用于动物实验。

1.2.2 小鼠建模 随机分为3组：空白组、咪喹莫特组(IMQ组)及治疗组(IMQ+MSC组)，每组3只。剃掉小鼠背部毛发，连续6 d在每只小鼠的背部均匀涂抹62.5 mg咪喹莫特乳膏。第6天，涂抹咪喹莫特乳膏后，空白组不予任何处理，IMQ组经尾静脉注射100 μL的无菌PBS溶液，IMQ+MSC组经尾静脉注射同体积的1×106的MSC悬浮液。48 h后，予颈椎脱臼法分别将各组小鼠处死，取背部皮肤组织备用。

1.2.3 PASI评分 采用PASI评分动态评估各组皮损的严重程度，红斑、鳞屑和皮损厚度评分为0～4分(0分：无；1分：轻度；2分：中度；3分：显著；4分：非常显著)。红斑+鳞片+皮损厚度的总分为最后评分。

1.2.4 HE染色 取合适大小的近后正中线的背部皮肤组织于4%的多聚醛溶液中室温固定24～48 h后脱水、石蜡包埋，制成3 μm厚的切片行苏木素和伊红染色。

1.2.5 免疫荧光染色检测皮肤组织中CD4+T细胞及CD11c+树突状细胞 取各组小鼠的病理切片行脱蜡、修复、封闭后，用大鼠抗鼠CD4+抗体(Biolegend，1 ∶500稀释)、大鼠抗鼠CD11c抗体(Biolegend，1 ∶500稀释)4 ℃孵育过夜，PBS泡洗后予相应二抗37 ℃孵育1 h，再次PBS泡洗后予DAPI荧光封片剂封存，共聚焦显微镜下观察图像并保存。

1.2.6 Western blot测定皮肤组织中TYK2及其磷酸化 液氮研磨各组小鼠的皮肤组织，通过裂解、离心获取样品上清液。根据BCA蛋白测定试剂盒说明书测定蛋白提取液的浓度。等量蛋白质(约50 μg)上样、电泳、转膜，5%的BSA封闭1 h后兔抗TYK2磷酸化抗体(Abmart，1 ∶500稀释)4 ℃过夜，TBST洗涤后室温孵育相应二抗1 h。将兔抗TYK2磷酸化抗体剥脱后，用5%的脱脂牛奶封闭1 h，兔抗TYK2抗体(Abmart，1 ∶1 000稀释)4 ℃过夜，TBST洗涤后室温孵育相应二抗1 h。均以GAPDH(锐抗，1 ∶5 000稀释)作为内源性对照，用ECL试剂在多功能凝胶成像仪中检测目的条带。利用ImageJ软件对图像进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 MSCs减轻银屑病样皮炎小鼠皮损严重程度

在第6天，与空白组相比，IMQ组及IMQ+MSC组均出现明显的红斑、鳞屑，PASI评分明显升高；在第8天，与IMQ组比较，IMQ+MSC组小鼠的红斑、鳞屑减轻，PASI评分下降(图1A～1E)。表明MSCs减轻了银屑病样皮炎小鼠皮损的严重程度。

图1 各组小鼠外观(1A)及红斑(1B)、鳞屑(1C)、皮损厚度(1D)评分、总PASI评分(1E)Figure 1 Clinical pictures(1A) and erythema score(1B), scale score(1C), skin thickness score(1D), total PASI score(1E) in each group.

2.2 MSCs减轻银屑病样皮炎小鼠的组织病理改变

建模第6天，咪喹莫特乳膏诱导IMQ组及IMQ+MSC组小鼠的HE染色可见角化不全、Munro微脓肿、表皮增厚;而在MSCs治疗2 d后，与IMQ组相比，IMQ+MSC组未见明显角化不全、Munro微脓肿，表皮厚度明显变薄(图2A、2B)。建模第8天，在IMQ组的皮损中可见大量CD4+T细胞及CD11+树突状细胞浸润，而IMQ+MSC组中CD4+T细胞及CD11+树突状细胞明显减少(图3)。证明MSCs可减轻银屑病样皮炎小鼠的组织病理改变及减少CD4+T细胞、CD11+树突状细胞的浸润。

图2 各组银屑病样皮炎小鼠皮肤组织病理学(2A,HE，200×)及第8天表皮厚度(2B)统计Figure 2 Histopathology (HE staining,200×) of lesions of psoriasis-like mice(2A) and epidermal thickness in each group(2B).

图3 免疫荧光检测第8天各组小鼠CD4+T细胞、CD11c+树突状细胞(200×)Figure 3 Immunofluorescence results of CD4+ T cells and CD11c+ dendritic cells in each group(200×).

2.3 MSCs抑制银屑病样皮炎小鼠TYK2的磷酸化

Western blot比较各组的TYK2及其磷酸化水平(图4),结果显示各组的总TYK2表达水平未见差异,但IMQ组TYK2磷酸化水平升高(1.233±0.163比0.634±0.117,P<0.05)，IMQ+MSC组在治疗后比IMQ组下降(0.501±0.074比1.233±0.163,P<0.05)，证明MSCs抑制了银屑病样皮炎小鼠TYK2的磷酸化。

图4 Western blot分析各组小鼠的TYK2及其磷酸化水平Figure 4 The levels of TYK2 and pTYK2/TYK2 of each group analyzed by Western blotting.

3 讨论

本研究探讨MSCs对银屑病样皮炎小鼠TYK2磷酸化的影响,结果显示MSCs的治疗可减轻咪喹莫特乳膏诱导的银屑病样皮炎小鼠红斑、鳞屑及PASI评分，并改善病变皮损的表皮厚度、炎症细胞浸润。此外，通过Western blot检测各组皮损的TYK2及其磷酸化水平，证明MSCs抑制了银屑病样皮炎小鼠TYK2的磷酸化水平，表明MSCs可通过抑制TYK2磷酸化减轻银屑病样皮炎小鼠皮损的严重程度。

银屑病的临床表现以局限或广泛分布的鳞屑性红色斑块为主，也可伴有系统疾病，皮损组织病理特征为角化过度、角化不全、Munro微脓肿、棘层肥厚及中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等炎症细胞浸润[10-11]。咪喹莫特乳膏作为一种Toll样受体7/8配体和强效免疫激活剂，反复涂抹可诱导并加重炎症性皮损，被广泛用于银屑病皮肤炎症模型[12]。本研究结果与既往研究[8]一致，咪喹莫特乳膏诱导小鼠出现银屑病样的红斑、鳞屑，组织病理也表现出银屑病的特征，包括角化过度、角化不全、Munro微脓肿和真皮炎症细胞浸润等；MSCs的治疗可明显缓解银屑病样皮炎小鼠的红斑、鳞屑、皮损厚度等临床表现，减轻表皮厚度、CD4+T细胞和CD11c+树突状细胞的浸润，验证了MSC具有强大的抗炎、免疫调节功能，对银屑病样皮炎小鼠有着良好的疗效。

TYK2作为JAK家族的成员之一，参与不同细胞因子如IL-12、IL-23启动的细胞内信号传递[13]，并在银屑病中参与了Th17细胞的增殖、活化[1]。在一项全基因组关联研究中，TYK2被确定为银屑病易感位点[14]。TYK2抑制剂显著减轻银屑病样皮炎小鼠皮损的严重程度及减少炎症因子产生[1, 4]。TYK2被认为是银屑病的治疗靶标之一[15]。目前已完成的Ⅱ期临床研究表明口服选择性TYK2抑制剂对中重度银屑病有着良好的临床疗效[1,13]。本研究结果显示MSCs的治疗抑制了银屑病样皮炎小鼠TYK2的磷酸化，证明MSCs一定程度上是通过抑制TYK2的磷酸化减轻银屑病样皮炎小鼠的严重程度。

综上所述，MSCs可通过抑制TYK2磷酸化缓解银屑病样皮炎小鼠的红斑、鳞屑、皮损厚度及相关炎症细胞浸润。