胃复春胶囊通过调节Bcl-2/Bax号通路诱导胃癌细胞凋亡

甄华 李振莲

（1.呼和浩特市第一医院药剂科，内蒙古 呼和浩特 010030；2.呼和浩特市检验检测中心，内蒙古 呼和浩特 010090）

胃癌（Gastric cancer）是胃黏膜病变的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率最高[1]。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。对胃癌的靶向治疗虽然可以针对性地损伤癌细胞，减轻正常细胞损害。但是目前研究证明靶向药物种类和治疗效果均有限，药物主要有细胞周期抑制剂、细胞凋亡促进剂、基质金属蛋白酶抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂等[2,3]。西药本身有不良作用大、易耐药等问题。在临床上胃癌的药物化学药品如5-氟尿嘧啶片主要用于不能手术治疗的患者或晚期患者的姑息治疗，临床疗效并不理想[4]，研究中成药从中寻找抗癌活性成分是近年来研究的热点[5]。

胃复春胶囊由红参、香茶菜（菱角三七）、枳壳（炒）组成，具有健脾益气、活血解毒的功效，临床上可用于治疗胃癌前期病变及胃癌手术后辅助治疗，效果突出[6,7]。因此，从药效学和作用机制角度对胃复春胶囊开展研究具有一定的意义。本文以人胃癌细胞株为对象，研究胃复春胶囊对胃癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响，探讨胃复春胶囊治疗胃癌的作用机制。

1 实验材料

1.1 人胃癌细胞株人胃癌细胞株NCI-N87 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 实验药品胃复春胶囊（杭州胡庆余堂药业有限公司，国药准字Z20090697）。

1.3 试剂实验所用抗体包括Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-w、GAPDH 均购于美国Cell Signaling Technology 公司；CCK-8 细胞活力检测试剂盒购于赛信通（上海）生物试剂有限公司；AnnexinV/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于翌圣生物科技（上海）有限公司；胎牛血清购于Invitrogen 公司；细胞浆蛋白抽提试剂盒购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；细胞培养液RPMI1640 购于北京四季青生物材料研究所；其他试剂（分析纯）购于北京试剂厂。

1.4 实验方法

1.4.1 样品的准备胃复春胶囊脱去胶囊壳后，称取内容物10 g，以100 mL 95%乙醇在室温下超声提取3 次，提取时间分别为20、20、20 min，合并3 次提取液后过滤除渣，减压浓缩，烘干，得到胃复春胶囊提取物粉末。溶解于DMSO，配制成1 mg/mL 的母液，实验时用培养液（DMEM）稀释至所需浓度。

1.4.2 细胞培养、细胞增殖的抑制实验将胃癌细胞株NCI-N87 细胞培养于含10%胎牛血清、100 µg/mL 链霉素、100 U/mL 青霉素的培养液（PMI1640）中，置于37 ℃湿度饱和的细胞培养箱内（95%空气，5% CO2），取对数生长期的细胞留做实验。取5×105/mL 的NCI-N87 细胞，200 µL/孔，96 孔板细胞培养板，待细胞贴壁，吸去培养基，每孔分别加入终浓度为25、50、100 µg/mL 的胃复春胶囊提取物，以同体积1640 培养液为空白对照。各质量浓度均设4 个复孔，分别继续培养至24、48、72 h，吸去药液，每孔加入含10%的CCK-8 的培养基100 µL，继续孵化4 h，测定各孔吸光度值（A）。细胞增殖抑制率（100%）=1-（实验组平均A 值-调零孔A 值）/（对照组平均A 值-调零孔A 值）

1.4.3 检测细胞凋亡（流式细胞术）接种NCI-N87 细胞，1×106/mL 浓度、6 孔细胞培养板，待细胞贴壁，然后再分别加入不同浓度为0、25、50、100 µg/mL 的胃复春胶囊提取物，继续24 h 培养细胞并收集细胞，离心固定，加入PI 和Annexin V-FITC，室温避光条件下染色、筛网过滤，使用流式细胞仪进行细胞凋亡实验。

1.4.4 检测细胞周期（流式细胞术）接种对数生长期的NCI-N87 细胞，1×106/mL 浓度、6 孔细胞培养板，等待细胞贴壁，然后再分别加入不同浓度为0、25、50、100 µg/mL 的胃复春胶囊提取物，继续培养细胞24 h 后，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS 洗细胞2 次。加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜，离心收集细胞，以1 mL的PBS 洗细胞1 次，加入500 µL PBS 含50 µg/mL 溴化乙 锭（PI），100 µg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min，以标准程序用流式细胞仪检测，计数2 万～3 万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit进行检测。

1.4.5 Western blot 检测蛋白表达量的变化NCI-N87 细胞以25、50、100 µg/mL 的胃复春胶囊提取物处理24 h后收集，按照试剂盒说明书指示，对NCI-N87 细胞浆蛋白进行抽提操作，提取细胞内总蛋白并测定蛋白浓度，以20 µg/孔上样，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后在ECL 发光液显色，观察各条带深浅变化。

1.5 统计学方法应用SPSS 21.0 统计软件进行统计处理。计量资料数据用（）表示，2 组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃复春胶囊提取物对NCI-N87 细胞活力的影响胃复春胶囊提取物在25、50、100 µg/mL 浓度下分别处理24、48、72 h，呈现不同程度抑制NCI-N87 细胞活力。胃复春胶囊提取物浓度和处理时间2 个因素与抑制细胞活力成正相关，即呈现明显的时间和剂量依赖效应。见图1。

图1 胃复春胶囊提取物可时间及剂量依赖地降低胃癌NCI-N87 细胞的活力

2.2 胃复春胶囊提取物对NCI-N87 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，胃复春胶囊提取物能够诱导NCI-N87 细胞凋亡。胃复春胶囊提取物（浓度为25、50、100 µg/mL）处理NCI-N87 细胞24 h 后，细胞凋亡率（早+晚）分别为20.6%、42.5%、50.2%，明显高于空白对照组凋亡率（3.6%），且其作用具有明显剂量依赖性。见表1。

表1 胃复春胶囊提取物诱导胃癌细胞凋亡 （）

表1 胃复春胶囊提取物诱导胃癌细胞凋亡 （）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 胃复春胶囊提取物对NCI-N87 细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示，胃复春胶囊提取物（浓度为25、50、100 µg/mL）处理NCI-N87 细胞24 h 后，G0/G1 期细胞比例增加，G2/M 期与S 期细胞比例减少。100 µg/mL 胃复春胶囊提取物处理后，NCI-N87 细胞的G0/G1 期细胞比例为78.08%，而G2/M 期与S 期细胞比例分别为2.75%、21.16%。提示胃复春胶囊提取物能使NCI-N87 细胞周期阻滞在G0/G1 期阶段，从而抑制细胞增殖。胃复春胶囊提取物处理后NCI-N87 细胞周期分布。见表2。

表2 胃复春胶囊提取物处理24 h 后胃癌细胞周期的变化（）

表2 胃复春胶囊提取物处理24 h 后胃癌细胞周期的变化（）

注：与同期空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 胃复春胶囊提取物对NCI-N87 细胞内Bcl-2 家族蛋白表达量的影响通过Western blot 测定后，本研究发现经过胃复春胶囊提取物（浓度为25、50、100 µg/mL）处理后，NCI-N87 细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 表达量显著上调，Bcl-2 家族蛋白中抗凋亡蛋白Bcl-w、Bcl-2 表达量下调，而促凋亡蛋白Bad、Bax 表达量上调。见图2。

图2 胃复春胶囊提取物对NCI-N87 细胞内Bcl-2家族蛋白表达量的影响

3 讨论

癌症是全球第二大死亡原因，在所有癌症中，胃癌的发病率约为7.81%，在全球范围内每年胃癌的发生和死亡的总数都在上涨。如今，胃癌患者最佳治疗手段还需要不断深入研究[8]。与化学药品相比，天然药物来源广泛、价格低廉、不良作用低。近年研究热点是中药及其有效部位或成分研究，在抗癌领域都已经取得了一系列的成果[9,10]。中医药防治胃癌前病变确有疗效，且安全不良作用低。胃复春是上市多年的老药，药效明确，安全有效。它具有益气健脾、活血解毒的功效，经常被用于治疗胃癌癌前期病变的患者、胃癌手术后辅助治疗的患者、慢性浅表性胃炎属脾胃虚弱证者。本文选择人胃癌细胞为研究对象，检测胃复春胶囊提取物的抗肿瘤作用，旨在揭示胃复春胶囊在胃癌治疗中的作用机制。通过CCK-8 实验，本研究发现胃复春胶囊提取物可以显著且呈时间及剂量依赖性地降低胃癌NCI-N87 细胞活力。进而本研究通过流式细胞术检测了胃复春胶囊提取物对NCI-N87 细胞的凋亡作用，发现胃复春胶囊提取物可以诱导NCI-N87 细胞凋亡，并使细胞周期进展受阻。

Bcl-2 蛋白家族是重要的细胞凋亡调节因子，主要包括抑制和促进细胞凋亡两类功能。目前已发现25 种Bcl-2 家族同源蛋白，其成员中有些促进凋亡，如Bid、Bad、Bax 等，有些成员阻止细胞凋亡，如Bcl-x、Bcl-2、Bcl-w 等。Bcl-2 能够阻止细胞色素C 从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡[11,12]。本文通过免疫印迹实验发现胃复春胶囊提取物可以浓度依赖地上调促凋亡蛋白Bax、Bad 的表达量，并下调抗凋亡蛋白Bcl-w、Bcl-2 的表达量，这说明了胃复春胶囊提取物具有诱导NCI-N87 细胞凋亡的活性可能与Bcl-2 蛋白家族有关。

综上所述，胃复春胶囊提取物具有抗肿瘤作用。本研究为临床应用中成药治疗胃癌患者提供了一定的参考，也为更加合理使用胃复春胶囊提供了新的依据。