单面针药材真伪鉴别研究及等级评价体系的初步建立

凌勇根，王月秀，冷其霖，刘 洋，谭喜平，龚 云，龚力民，林丽美，张 鹏*

（1.株洲千金药业股份有限公司，湖南 株洲 412007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

单面针又名山枇杷、大叶花椒、蚬壳花椒等[1]，为我国南方重要的珍稀木本药用植物资源[2]，主产于我国西南及湖南、湖北、广东、广西等地[3]。 其主要含有多种生物碱[4-5]、内酯类[6]和黄酮类[7]等化学成分，具有活血散瘀、祛风除湿、理气止痛的功效。单面针为芸香科植物蚬壳花椒（Zanthoxylum dissitum Hemsley）或刺壳花椒（Zanthoxylum echinocarpum Hemsley）的干燥根和茎[8]。 同属植物两面针为芸香科植物两面针[Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.]的干燥根，具有活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿功效，用于治疗跌打损伤、胃痛、牙痛等[9]，两者的化学成分的相似，混用现象较常见，市场上常见的伪品还有野生花椒等，上述混伪品严重影响了单面针药材的安全应用和质量保障。

“辨状论质”作为中药品种传统经验鉴别，最早由我国著名中药学家谢宗万教授概括提出[10]，即通过“辨状”，包括药材的形状、大小、色泽、表面特征、质地、 断面特征及气味等来辨别药材的真伪和评判药材的优劣，即“论质”。 也有报道以性状特征[11]、红外光谱[12]、分子生物学[13]和质谱技术[14]等进行区分，但关于系统地薄层色谱法和高效液相色谱法却少有报道。 本研究采用薄层色谱法和高效液相色谱法系统地比较分析，旨在找到单面针与两面针及混伪品的明显区分点，为单面针真伪鉴别和质量控制提供参考。

《七十六种药材商品规格标准》[15]作为中药材分级的国家标准，执行至今已有35 年，但单面针药材一直未被收录，本研究收集30 批单面针药材，通过对不同批药材的性状、杂质、直径、水分、灰分、二氧化硫残留量、重金属和有害元素残留量、醇溶性浸出物及木兰花碱含量进行检测和分析，采用SPSS 19.0统计软件分析单面针药材等级与各质控指标之间的相关性，建立了初步的等级评价体系，为优质的单面针药材质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ATS 4 薄层色谱全自动点样仪、ADC 2 薄层色谱全自动展开仪、Derivatizer 薄层色谱全自动喷雾系统、Visualizer 2 薄层色谱数码成像系统（瑞士CAMAG 公司）；TH-II 薄层色谱显色加热器 （上海科哲生化科技有限公司）；Waters e2695 型高效液相色谱仪、Waters 2998 型PDA 检测器（美国Waters 公司）；iCAP RQ ICP-MS 电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；AB204-S 型电子天平、AB135-S 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SM100 型切割室研磨仪[弗尔德（上海）仪器设备有限公司]；114B 型摇摆式中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；A11 型分析型研磨仪（德国IKA 公司）；DZAKW-D-6 型恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；SX2-4-10 型系列箱式电阻炉（上海力辰仪器科技有限公司）。

1.2 试药

木兰花碱对照品（批号：M-026-180524）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；氯化两面针碱（110848-201604）购于中国食品药品检定研究院。甲醇（批号：P1441123）、95%乙醇（批号：P1433419）、三氯甲烷（批号：P1318320）、乙醇（批号：P1437228）、乙酸乙酯（批号：P1429095）、氨水（批号：P1375833）、二氯甲烷（批号：P1454839）、二乙胺（批号：P1382819）均为分析纯，购于General-Reagent 公司；甲醇（批号：P1433419）、甲酸（批号：P1441123）为色谱纯，购于General-Reagent 公司。药材均为株洲千金药业股份有限公司提供，经由湖南中医药大学龚力民教授鉴定，单面针为芸香科植物蚬壳花椒（Zanthoxylum dissitum Hemsley）或刺壳花椒（Zanthoxylum echinocarpum Hemsley）的茎，两面针为芸香科植物两面针[Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC.]的根，野花椒为芸香科植物野花椒（Zanthoxylum simulans Hance.）的茎，飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血[Toddalia asiatica(L.)Lam.]的茎。 详见表1。

表1 实验样品信息

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法

2.1.1 供试品溶液的制备 取供试品粉末（过二号筛）2 g，置具塞锥形瓶，加乙醇40 mL，密闭，超声处理60 min，过滤，水浴蒸干，残渣加2 mL 乙醇溶解即得，作为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 取木兰花碱、氯化两面针碱对照品适量，分别加乙醇制成1 mL 中含1 mg 和0.5 mg 的对照品溶液。

2.1.3 薄层色谱鉴定 照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0502）[16]试验，吸取上述对照品溶液5 μL；供试品溶液5～10 μL 分别点于同一硅胶GF254 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-二乙胺（40∶10∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，在365 nm 下检视。 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.4 样品结果 采用上述色谱法对4 批蚬壳花椒（S1～S4）、3 批刺壳花椒（C1～C3）、4 批两面针样品（LS26～LS29）及3 批伪品[1 批飞龙掌血（W1）、2 批野花椒（W2、W3）]进行薄层鉴别，结果样品中斑点清晰，不同基原样品具有良好的一致性，在Rf=0.9处，各有两条亮红色斑点，可以作为单面针与两面针及伪品的鉴别点，可以达到区分伪品的目的。薄层图谱见图1。

图1 薄层色谱样品检测

2.2 高效液相色谱法[17]

2.2.1 色谱条件与系统适应性 色谱柱为Waters SunFire C18（柱长25 cm，内径为4.6 mm，粒径为5 μm），以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（表2）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为268 nm。 理论塔板数按木兰花碱计算应不低于5000。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液的制备 取木兰花碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含木兰花碱60 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别取30 批单面针和15 批两面针样品，粉碎，过3 号筛，约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2.5 样品结果 单面针药材标志性成分主要为1号峰和2 号峰（木兰花碱），通过单面针与两面针色谱图对比分析，1 号峰可作为区分单面针和两面针的特征性成分。 30 批单面针图谱和15 批两面针图谱见图2-4。

图2 单面针色谱图

2.3 外观特征

2.3.1 性状 按照《湖南省中药材标准》（2009 年版）[8]规定对30 批单面针药材进行测定。

本品为类圆形。茎表面灰褐色或暗灰色，有纵向突起的棱纹或皮孔，乳头状突起的皮刺或椭圆形的皮刺疤痕。质坚硬，难折断，切面皮部极窄，木部黄白色或淡棕红色，可见同心性环纹及密集的射线。髓部白色，迎光可见闪烁的小亮点。 味稍苦而有刺喉感。

2.3.2 直径样品测定 取30 批单面针药材，直径按照《中华人民共和国药典》（2020 年版）四部[16]规定进行测定，结果见表3。

表3 30 批单面针外观特征测定结果

图3 两面针色谱图

图4 单面针及两面针液相鉴别区分点

2.3.3 样品结果 30 批单面针样品直径范围1.1～2.8 cm，变异幅度达到1.7 cm，说明不同产地单面针直径大小存在一定差异，通过感官可直接分辨大小。

2.4 内在质量

2.4.1 样品测定 取30 批单面针药材，杂质、水分、总灰分、醇溶性浸出物、重金属及有害元素、有机氯农药残留、二氧化硫残留量按照《中华人民共和国药典》（2020 年版）四部[16]规定进行测定，木兰花碱含量按照“2.2”项进行测定，结果见表4-6。

表4 30 批单面针水分、总灰分、浸出物、含量测定结果

2.4.2 样品结果 杂质的含量为1%～3%。水分的含量为7.2%～9.2%，均不超过《湖南省中药材标准》（2009 年版）中单面针水分规定的限量14.0%。 总灰分的含量为2.3%～3.9%，均不超过《湖南省中药材标准》（2009 年版）中单面针总灰分规定的限量5.0%。醇溶性浸出物的含量为3.9%～7.0%，平均值5.4%，均符合《湖南省中药材标准》（2009 年版）中单面针浸出物规定的限量3.0%。重金属及有害元素中铅的含量为0.5～3.2 mg/kg、镉的含量为0.1～0.6 mg/kg、砷的含量为0.04～0.2 mg/kg、汞的含量均未超过0.01 mg/kg、铜的含量为2.2～8.3 mg/kg。 均在中国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[18]规定限度内，处于安全水平。总六六六、总滴滴涕、五氯硝基苯均未检出，故本品未规定有机氯农药残留量的限度。 二氧化硫残留量均未超过150 mg/kg，均不超过《中华人民共和国药典》（2020 年版）四部[16]中二氧化硫残留量规定的限量150 mg/kg。

单面针中的木兰花碱具有明显的抗炎、抗菌等药理作用[19]，通过对不同产地单面针进行木兰花碱含量测定，结果表明单面针木兰花碱含量为0.05%～0.19%，说明不同产地的单面针样品中木兰花碱含量存在差异。

表5 30 批单面针重金属及有害元素测定结果(mg/kg)

2.5 单面针药材等级评价体系的初步研究

2.5.1 实验材料 样品信息见表2，批号为S1～S30，共计30 批。

2.5.2 等级划分指标的确定 采用软件SPSS 19.0对30 批单面针样品外在特征和内在质量进行统计分析，见表7-9。

由表7 各指标的描述统计可知，单面针外观特征指标杂质与直径的变异系数分别为44.4%、22.2%。单面针内在指标成分木兰花碱含量、总灰分、浸出物的变异系数分别为40.00%、17.9%、16.7%。 由表8各指标的相关性分析可知，直径、木兰花碱含量、浸出物、总灰分在0.01 水平上呈显著的正相关。 由表9 对各指标的主成分分析可知， 主成分一的特征值为2.019，贡献率为33.651%；主成分二的特征值为1.659，贡献率为27.642%；主成分三的特征值为1.090，贡献率为18.160%，累积贡献率为79.453%，特征向量的大小代表各性状指标对主成分贡献的大小，综合考虑特征值和贡献率的大小，结合实际情况和可操作性，故选用直径、浸出物、木兰花碱含量作为药材等级划分指标。

表6 30 批单面针有机氯农药残留量、二氧化硫残留量测定结果(mg/kg)

表7 单面针各测定指标的描述统计

表8 单面针各指标间相关性分析

表9 主成分分析

2.5.3 分级 将每批单面针样品的直径、浸出物、含量作为聚类指标，运用SPSS 19.0 统计分析软件对30 批单面针样品进行分析，结果见图5。

由图5 可以看出，将30 批单面针样品分为3类：样品S4 聚为一类，为一等品；样品S11、S12、S13、S14、S15、S16、S20、S22、S23 聚为一类，为二等品；其他20 批样品聚为一类，为统货样品，详见表10。 初步建立了单面针药材质量等级评价体系：1 批一等：醇溶性浸出物不少于6.8%，直径不小于2.8 cm，木兰花碱含量不少于0.19%；9 批二等：醇溶性浸出物5.8%～7.0%，直径1.3～2.2 cm，木兰花碱含量0.05%～0.17%；20 批三等：醇溶性浸出物3.9%～5.8%，直径大小不等，木兰花碱含量0.06%～0.16%。

表10 单面针药材等级评价指标

图5 30 批单面针样品各指标聚类分析树状图

3 讨论

3.1 薄层色谱法

生物碱类化合物是单面针的主要活性成分之一，主要包含木兰花碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱等，通常是评价该药材质量的重要指标[20-21]。 以白屈菜红碱[22]为对照进行薄层鉴别时，单面针特征斑点不明显，而两面针和伪品斑点特别明显[9]，故未选择白屈菜红碱作为定性指标。 选择了木兰花碱和氯化两面针碱为对照，进行了供试品溶液的制备方法、薄层色谱鉴别展开条件的考察及方法学验证，薄层色谱鉴别可以很好分离和区分单面针、两面针及伪品，提取方法简单、快捷，斑点清晰，所用试剂易获取，便于操作。

3.2 高效液相色谱法

单面针与两面针均来源于芸香科，化学成分比较相似，采用高效液相色谱法对不同产地单面针和两面针进行对比分析，筛选出主要的差异成分为1 号峰，后续需对1 号峰进行提取分离、结构确证、药理药效研究，以确证1 号峰作为单面针特征性成分加以控制，以保障单面针基原准确，区分真伪品。

3.3 其他检测项

按照《湖南省中药材标准》（2009 年版）、《中华人民共和国药典》（2020 年版）等方法对不同产地单面针药材杂质、直径、水分、总灰分、醇溶性浸出物、重金属及有害元素、有机氯农药残留量、二氧化硫残留量、木兰花碱的含量等进行了全面的质量检测，均符合现行质量标准及药典要求，可为单面针质量标准完善提供数据支撑。

3.4 等级评价

通过对单面针药材外观特征和内在质量的全面分析，从描述性统计、相关性分析、主成分分析等确定了等级划分指标。采用聚类分析对30 批单面针药材建立了初步的三级等级评价体系，结果显示，直径越大，内在质量越优。一等品1 批，产地为湖南怀化；二等品共9 批，产地分别为湖南吉首5 批以及湖北、广西、广东、贵州各1 批；三等品共20 批，各个产地均有分布。 不同省份不同批样品质量波动较大，同一省份不同批药材也有一定的差异，但相对来讲，湖南省样品相对优质且批间稳定。由于收集到的30批单面针药材生长年份不明确，故后续需对不同生长年份单面针质量进行更多的相关性和影响趋势研究。

4 结论

本研究确证了薄层色谱法和高效液相色谱法能够有效地鉴别和区分单面针药材与两面针药材及常见混伪品，方法专属性强、灵敏度高、简便实用，薄层色谱法与高效液相色谱法能够相互验证、互为补充，提供了有效的质控手段，为规范中药材市场奠定了基础。 将传统的外观特征结合内在有效成分含量，初步建立了单面针3 个规格药材的评价体系，实践中容易掌握，为评价单面针药材质量提供了数据支持，对药材的采收与产地加工具有一定的指导和实践意义，可以促进单面针商品药材的市场价格秩序化、合理化，以满足不同的临床应用需求。