延龄草多糖增强免疫作用研究

查雨锋 詹 易 李 婷 颜 宏 黄加文 吴德松*

1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2. 云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111

免疫系统是机体自我保护的防御性结构，它对人体的健康起着举足轻重的作用，免疫系统的缺失或失调会引起自身免疫性疾病、病原体感染、肿瘤等病症的发生。植物多糖是存在于生物体内的一类生物大分子物质，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、促进机体免疫力等生物活性[1]，而免疫调节作用是其最重要的生物活性功能，一直是人们研究的热点[2]。延龄草TrilliumtschonoskiiMaxim.为百合科延龄草属植物，别名头顶一颗珠、七叶一枝花、芋儿七等，主产于我国陕、鄂、川、湘等地。味甘，性平，有小毒，是传统的名贵中药，具有镇静安神、活血止血、解毒等功效[3]。药理学研究[4-8]表明，延龄草提取物具有抗癌、抗氧化、抗炎、镇痛、凝血及免疫调节等作用。但截至目前，针对延龄草调节免疫作用研究的文献报道较少，且文献中所使用的实验模型和方法较为单一，另外，延龄草免疫调节作用与其成分中的多糖是否具有相关性也未见文献报道。因此，本研究基于延龄草在免疫调节作用研究中的不足，对其多糖的特性免疫及非特异性进行全面研究，为延龄草多糖在免疫调节方面的药理研究提供实验依据，并为今后延龄草多糖免疫调节药物、增强免疫力保健食品的开发提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源及制备 原植物经云南省药物研究所天然药物资源研究室朱高倩博士鉴定为百合科多年生草本植物延龄草TrilliumtschonoskiiMaxim.。制备时，取延龄草干燥根茎粉末2.0 kg，用95%乙醇回流提取，取药渣，用热水回流提取3次，滤过，合并提取液离心，取离心液放入有机膜设备中，用超滤膜过滤(M>10000Da)后，滤液再过纳滤有机膜(10000Da>M>300Da)，取未过纳滤膜成分，用4倍量的95%乙醇醇沉，4 ℃过夜后离心，取沉淀冻干即得103.2 g延龄草多糖，得率为5.16%。采用苯酚-硫酸法测得多糖含量为64.1%。

1.1.2 实验动物 SPF级KM小鼠，体重为18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2020-0004。

1.1.3 主要试剂 二硝基氟苯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，批号：68XJB-MT；绵羊红细胞，北京索莱宝科技有限公司，批号：20200911；3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT钠盐)，北京索莱宝科技有限公司，批号：C10898415；刀豆蛋白A(ConA)，北京索莱宝科技有限公司，批号：109R031； RPMI1640培养液，Gibco公司，批号：8120199；胎牛血清，Gibco公司，批号：1993361；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20201105。

1.1.4 主要仪器 SQP电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；JJ2000型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；AC2-6S1型二级生物安全柜，新加坡ESCO公司；CCL-170A-8型CO2恒温培养箱，新加坡ESCO公司；3H12RI型高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；DMIL-LED型倒置相差显微镜，德国莱卡公司；GNP-9270隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪，ThermoFisherScientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠急性毒性试验 参照文献[9-10]方法，取40只KM小鼠，雌雄各半，称重后随机分为两组，即溶媒对照组和受试样品组。用纯水将受试样品配制成利于小鼠灌胃的最大浓度(135.0 g/L)，小鼠禁食不禁水12 h，采用最大给药量法在24 h内按40 mL/kg的给药体积3次灌胃给予受试样品，给药间隔4 h，给药后观察小鼠状态、体重变化、毒性反应和死亡等情况，并连续观察14 d。对实验期死亡动物以及结束期处死动物进行解剖，观察动物内脏器官的体积、颜色、质地等有无明显异常。

1.2.2 对小鼠免疫器官的影响 参考相关文献[11-14]发现，大多植物多糖在100～500 mg/kg剂量范围内具有明显的免疫促进作用，因此本研究以此作为参考设定延龄草多糖的小鼠给药剂量。取48只雄性KM小鼠，随机分为4组，每组12只动物，即溶媒对照组、延龄草多糖100、200、400 mg/kg剂量组。延龄草多糖各剂量组按20 mL/kg给药体积灌胃给药，连续给药14 d，溶媒对照组给予纯水。于给药后第14天称重动物，处死后将其胸腺和脾脏分离出并称重，计算胸腺/体重和脾脏/体重比重[15-16]。

1.2.3 对小鼠细胞免疫的影响

1.2.3.1 迟发型变态反应实验 动物分组及给药情况同“1.2.2项”， 参照文献[15-16]方法，于给药后第7天，用二硝基氟苯溶液涂抹于小鼠腹部诱导致敏，于给药后第14天，用10 μL二硝基氟苯溶液均匀涂抹于小鼠右耳进行激发。激发24 h后处死小鼠，剪下左右耳。用打孔器取下直径8 mm的耳片，称重，用左右耳重量之差表示迟发型变态反应的程度。

1.2.3.2 ConA诱导脾淋巴细胞转化实验 动物分组及给药情况同“1.2.2项”，在末次给药1 h后处死各组动物，无菌条件下分离脾脏，制备成单个脾细胞悬液，计数并调整细胞浓度。将脾细胞培养于24孔板中，并加入ConA进行诱导，对照组则加入相同体积的空白培养液，置培养箱中孵育72 h。采用XTT法测定各孔脾淋巴细胞增殖活性[15-16]。

1.2.4 对小鼠体液免疫的影响

1.2.4.1 血清溶血素生成实验 动物分组及给药情况同“1.2.2项”，于给药后第7天，腹腔注射2%(V/V)的绵羊红细胞对小鼠进行免疫诱导，于第14天取血分离血清。用生理盐水将血清进行倍比稀释，布于96孔U型板内并加入0.5%(V/V)的绵羊红细胞，37 ℃孵育4 h，观察红细胞凝集程度，计算抗体(血清溶血素)积数[15-16]。

1.2.4.2 抗体生成细胞检测 动物分组及给药情况同“1.2.2项”，于给药后第7天，每只小鼠腹腔注射绵羊红细胞进行免疫诱导，于给药后第14天处死动物，无菌条件下分离脾脏，制备成单个脾细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个细胞/mL。取50 μL绵羊红细胞、200 μL脾细胞悬液加入试管中(内含0.5 mL浓度为5 mg/mL的琼脂糖)，倒入包被琼脂糖的6孔板中混合均匀，每个样本做两个平行孔。放入培养箱中孵育1 h，然后每孔加入500 μL补体，继续孵育2 h，计数溶血空斑数，结果以空斑数/106脾细胞表示[15-16]。

1.2.5 对小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力的影响 动物分组及给药情况同“1.2.2项”，各组动物于给药后第14天称重，尾静脉注射印度墨汁溶液。注入墨汁后2、10 min从内眦静脉丛取20 μL全血，并立即加到 2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液作空白对照，在600 nm波长处测吸光度值，处死动物并分离肝脏和脾脏进行称重，以吞噬指数a表示小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力[15-16]。

1.2.6 对NK细胞活性的影响 动物分组及给药情况同“1.2.2项”。在末次给药1 h后处死各组动物，无菌条件下分离脾脏，制备成单个脾细胞悬液，并与小鼠淋巴瘤细胞(YAC-1细胞)按50:1的比例共培养于96孔U型板中。以单独培养的YAC-1细胞作为自然释放孔，在YAC-1细胞单独培养孔中加入2.5%Triton裂解液作为最大释放孔，孵育4 h后，采用LDH试剂盒测定各孔上清吸光度值，并计算NK细胞活性[15-16]。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性试验 溶媒对照组所有动物给予纯水后一般状况良好，未见明显毒性反应。小鼠灌胃给予延龄草多糖后连续观察4 h内以及观察期14 d内，所有动物均未见明显毒性反应。各组动物给药后体重均持续增长，与溶媒对照组比较，延龄草多糖组动物体重差异无统计学意义(P>0.05)。观察结束后脱臼颈椎处死动物并进行大体解剖观察，所有小鼠各组织、器官均未见明显异常。延龄草多糖对小鼠经口急性毒性试验的最大给药量为16.2 g/kg。结果见表1、表2。

表1 延龄草多糖小鼠灌胃给药急性毒试验动物毒性反应及死亡情况

表2 延龄草多糖小鼠灌胃急性毒性试验动物体重变化情况

2.2 延龄草多糖对小鼠免疫器官的影响 与溶媒对照组比，延龄草多糖各剂量组对小鼠脾脏/体重比值和胸腺/体重比值均无明显影响(P>0.05)。结果见表3。

表3 延龄草多糖对小鼠免疫器官的影响

2.3 延龄草多糖对小鼠细胞免疫的影响 结果显示，与溶媒对照组比较，延龄草多糖200、400 mg/kg剂量组均能明显升高小鼠耳廓肿胀度，差异具有统计学意义(P<0.05)，延龄草多糖100、200、400 mg/kg剂量组均能明显升高小鼠脾淋巴细胞转化活性，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表4。

表4 延龄草多糖对小鼠细胞免疫的影响

2.4 延龄草多糖对小鼠体液免疫的影响 结果显示，与溶媒对照组比较，延龄草多糖100、200、400 mg/kg剂量组均能明显升高小鼠血清中的抗体积数，差异具有统计学意义(P<0.05)，延龄草多糖400 mg/kg剂量组能明显升高溶血空斑数，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表5。

表5 延龄草多糖对小鼠体液免疫的影响

2.5 延龄草多糖对小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力及NK细胞活性的影响 结果显示，与溶媒对照组比较，延龄草多糖200、400 mg/kg剂量组均能明显升高小鼠NK细胞活性，差异具有统计学意义(P<0.05)，但各剂量组对小鼠碳廓清吞噬指数均无明显影响，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表6。

表6 延龄草多糖对小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力及NK细胞活性的影响

3 讨论

随着分子生物学、细胞生物学等相关学科的不断发展，人们对多糖的研究也不断深入，多糖生物学已成为国际争夺生物化学研究领域的制高点，是继蛋白质、基因工程后生物化学和分子生物学领域中的前沿科学[17]。而植物多糖作为众多糖中的成分之一，参与细胞的各种生理活动，具有多种药理活性及生理作用，是极具发展潜力的资源之一。免疫调节是众多植物多糖中较为普遍和重要的生物活性，而且植物多糖对机体的免疫调节作用往往是正向调节。目前，在已提取得到的300多种植物多糖中，有100余种多糖具有免疫促进作用[18]。研究[19]表明，植物多糖可激活T/B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞，促进抗体生成和多种细胞因子的释放，激活补体系统等调节机体免疫力。根据植物多糖的免疫促进作用，可将其开发为免疫制剂，用于免疫力低下的治疗，或用于肿瘤免疫治疗，亦可作为增强免疫力保健食品的重要原料。延龄草多糖同属植物多糖，其免疫调节作用同样具有进一步研究和开发价值。

免疫反应是机体的一种自我防御形式，良好的免疫力是保证身体健康的根本起点，免疫器官、免疫细胞和免疫分子共同组成了人体的免疫系统，他们之间相互协调和配合完成了机体的特异性免疫和非特异性免疫，体液免疫和细胞免疫属于特异性免疫，而单核-巨噬细胞吞噬和NK细胞活性属于非特异性免疫。本研究通过全面考察延龄草多糖对小鼠特异性免疫及非特异性免疫的作用，以阐明其是否具有免疫增强作用及其免疫调节作用的特点。本研究发现，延龄草多糖可明显加重小鼠迟发型变态反应的程度，升高脾淋巴细胞转化活性，提高小鼠抗体细胞的生成和血清中的抗体积数，表明延龄草多糖可通过调节细胞免疫和体液免疫而发挥增强免疫的作用。此外，延龄草多糖还能明显提高小鼠NK细胞的活性，但其对小鼠碳廓清吞噬指数无明显影响，表明延龄草多糖可通过部分调节非特异性免疫而发挥免疫增强作用。

胸腺和脾脏是哺乳动物机体中重要的免疫器官，其发育状况与机体免疫能力的高低有着直接的关系，胸腺和脾脏指数反映了免疫器官的发育和免疫功能[20]。本研究结果显示，延龄草多糖虽然对小鼠脾脏/体重比值、胸腺/体重比值无显著促进作用(P>0.05)，但具有增加小鼠脾脏/体重比值、胸腺/体重比值的趋势，且具有一定的剂量依赖性。

小鼠灌胃急性毒性试验结果显示，延龄草多糖的最大给药量为16.2 g·kg-1，且试验中未观察到实验动物出现明显的毒性反应，小鼠各组织、器官也未发现明显异常，表明延龄草多糖对小鼠毒副作用较小，其安全性较好。

综上所述，延龄草多糖可通过调节小鼠细胞免疫、体液免疫及NK细胞活性，从而达到增强免疫力的作用，具有进一步研究和开发的价值，为今后延龄草多糖免疫调节药物、增强免疫力保健食品的开发提供了实验依据。