基于网络药理学探究补肾活血汤治疗肾虚血瘀型膝骨性关节炎的作用机制*

石佳，刘爱峰，靳博，崔中赏，张聪聪

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300381；2.天津中医药大学，天津 301617）

膝骨性关节炎（KOA）是一种慢性退行性关节病，常表现为软骨下骨质增生硬化、滑膜无菌性炎症、软骨剥脱等特征，导致患者膝关节活动疼痛、僵硬和活动严重受限，其病因病机现尚无统一定论。中医药治疗KOA，更具简便效廉之优，减轻患者经济负担，提高生活质量，缓解临床症状[1]。

KOA属“痹证”“骨痹”范畴，肝肾不足则风寒湿之邪易于侵入，气机运行不畅，日久则气血瘀滞而发病，故其病为本虚标实之证，肝肾亏虚为本，气滞血瘀为标，临证亦以肾虚血瘀最为常见[2]。清代赵竹泉所著《伤科大成》中补肾活血汤（BHD）由熟地黄、当归尾、没药、山茱萸、菟丝子、破故纸、杜仲、枸杞子、肉苁蓉、红花和独活11味药组成，可达补肾壮筋，活血止痛之效。因其成分较为复杂，治疗KOA机制仍需探索。网络药理学作为中医药研究的一个新兴领域，通过构建“药物-成分-靶点”网络，探讨药物与机体的作用[3]。文章旨在通过网络药理学方法，挖掘分析BHD治疗肾虚血瘀型KOA的具体有效化学组分和药效靶点，筛选主要靶点与通路深入探析，并对此方治疗KOA作用机制予以进一步明确，以作为临床用药的有效参考。

1 材料与方法

1.1 补肾活血汤主要作用靶点和相关疾病靶点的收集 通过Swiss Target Prediction搜索BHD的中药，按照以下筛其主要活性成分靶点：一是口服生物利用率高于30%；二是药物相似性须高于0.18。运用 GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库检索与KOA基因相关的数据资料。经相互分析后，得出BHD与KOA的共同靶点蛋白。

1.2 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、药物-成分-靶点图的构建 根据得出的结果，继而使用Cytoscape3.6.1结合STRING数据库构建出网络药理学分析研究所需的药物—成分—靶点网络。

1.3 靶点通路分析 将靶点结果输入DAVID数据库，通过输入靶基因名称列表并选定物种为“homo sapiens”，点击Custom analysis设置参数分析，进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）与基因功能（GO）富集分析。

1.4 分子对接 分子对接处理是分析药方对病症的具体干预机制。将药物靶点化合物按其度值排序，选其度值前10位的化合物，依下流程与肿瘤坏死因子（TNF），蛋白激酶 B1（AKT1），人磷酸肌醇-3-激酶催化亚基G肽（PIK3CG）等相关的蛋白进行分子对接操作。

1.4.1 对小分子及蛋白处理 单体小分子化合物首先使用Syby12.0软件进行模拟构建和结构的能量优化，结果存储为mol2格式文件。在蛋白数据库（PDB）下载TNF，PIK3CG，AKT1蛋白晶体结构，蛋白 ID 为 3KMC，6AUD，6HHI，并在 Syby12.0 中将蛋白分为有配体和无配体两种类型，其分类结果分别存储为PDB格式文件。

1.4.2 进行分子对接操作 该操作涉及LGA遗传算法，应用软件AutoDock4.2。

首先通过该软件打开无配体蛋白PDB文件，模拟加入电荷以确定各个蛋白晶体具体结合域，设置xyz轴规格均为40格点的结合晶格。导入生成的mol2格式文件并生成pdbqt文件，基于该文件在结合晶格处与蛋白用遗传算法虚拟对接操作。其运行次数设置为30轮次，小分子旋转键扭转及四元数的次数均为30，其他使用软件默认设置。

1.4.3 对接结果分析 将对接结果按照结合能绝对值的大小由高到低排序，选择其中绝对值最高的构相，使用Pymol软件模拟可视分析其具体的结合位点并保存操作结果。

2 结果

2.1 药物-化合物-靶点网络 将上述分析得出的82种主要活性化合物使用Swiss Target Prediction数据库预测其主要活性成分调控靶点，将其重复部分去除，最终筛选出靶点数量为615个。续用Cytoscape生成“药物—成分—靶点”网络，具体结果如图1所示，该网络有1 993条边及669个节点。

图1 补肾活血汤药物-成分-靶点图Fig.1 Bushen Huoxue Decoction drugs-composition-target diagram

表1列举了对该网络进行拓扑分析的参数设置，其目的是为了明确各个活性成分调控的作用程度，对应的靶点边数越多则调控程度越高。其排名前10的成分为蛇床子素、川白芷素、二氢山芹醇醋酸酯、伞形酮等为BHD的主要活性成分。

表1 PPI网络拓扑分析参数表Tab.1 PPI network topology analysis parameter table

2.2 预测补肾活血汤治疗膝骨性关节炎的靶点 根据GeneCards数据库对KOA的治疗靶点检索，设置相关性大于5的条件进行筛选，得到564个相关靶点数量，再用Venn平台将KOA靶点与BHD靶点进行交集筛选，最终得出总数为82的靶点集合，见图2。

图2 补肾活血汤治疗膝骨性关节炎靶点Venn图Fig.2 Venn figure of the target of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of knee osteoarthritis

2.3 补肾活血汤与膝骨性关节炎蛋白质相互作用核心网络的构建 将上述82个靶点在STRING平台上进行PPI网络分析，核心网络图（图3）包含918条边，节点数为82个，其中节点表示蛋白，每条边即代表两个蛋白之间存在相互作用，关联度与线条数量成正比；该网络中靶蛋白节点度均值22.4，其中有36个靶蛋白节点度均超过均值，这些靶蛋白可视为关键靶点，也是BHD的调节作用来源。表2中将排名前20的关键靶点进行排序，其中TNF、转录激活因子 3（STAT3）、丝裂原激活的蛋白激酶 1（MAPK1）等多个靶点均与炎症性疾病有高度关联。

图3 补肾活血汤与膝骨性关节炎蛋白质相互作用核心网络（PPI）图Fig.3 Core network（PPI）diagram of protein interaction between Bushen Huoxue Decoction and knee osteoarthritis

表2 补肾活血汤PPI网络中大于平均度值的前20靶标蛋白Tab.2 Top 20 target proteins in the PPI network of Bushen Huoxue Decoction were higher than the average value

2.4 补肾活血汤靶点通路分析 在DAVID数据库中使用以上分析得出的82个靶点进行GO富集分析与KEGG通路注释，得出分子功能、生物过程和细胞成分的GO条目与富集通路数量分别为119个和95条，根据以上结果得出图4中所示的TOP10富集柱状图，为GO富集到药物所调节的相关生物功能。GO功能富集主要涉及凋亡信号途径、外部刺激反应的正向调节、炎症反应等。KEGG通路分析按照P值排列前20通路分析后发现，KEGG通路主要参与调控TNF信号通路，缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，类风湿性关节炎，破骨细胞分化，PI3K-Akt信号通路等。见图5。其中主要通路涉及的相关靶点为 TNF，AKT1，MAPK1，MAPK14，PI3KCG 等。BHD的成分靶点与KEGG通路交互网络寻找主要的蛋白靶点，见图6，KEGG通路中与KOA相关的通路主要涉及TNF，类风湿性关节炎，破骨细胞分化，PI3KAkt信号通路，对通路中靶点进行PPI网络分析，见图7，按照P值排列，TNF信号通路排第一位，通路中涉及的靶点主要如表3所示。通过STRING分析平台，将TNF信号通路中的靶点进行PPI交互网络的构建，见图8，得到通路中的TNF，PIK3CG，AKT1的相关性较好，因此将进一步选取前10个主要成分对炎症靶点进行分子对接验证。

图4 补肾活血汤靶点的GO富集分析图Fig.4 Go enrichment analysis diagram of Bushen Huoxue Decoction target

图5 补肾活血汤治疗膝骨性关节炎的KEGG富集分析图Fig.5 KEGG enrichment analysis of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of knee osteoarthritis

图6 补肾活血汤成分-靶点-通路图Fig.6 Ingredients-target-pathway chart of Bushen Huoxue Decoction

图7 补肾活血汤与膝骨性关节炎相关蛋白网络图Fig.7 Related proteins network map of Bushen Huoxue Decoction and knee osteoarthritis

图8 补肾活血汤参与TNF信号通路的PPI网络图Fig.8 PPI network diagram of Bushen Huoxue Decoction and TNF signaling pathway

表3 涉及TNF信号通路的靶点Tab.3 Targets involved in the TNF signaling pathway

2.5 分子对接 分子对接验证中，结合能数值如表4所示，药物的主要成分中：蛇床子素，川白芷素，藁本内酯，伞形酮及阿魏酸等，与AKT，TNF，PI3KCG的对接效果较好。显示BHD的主要成分具有潜在调节炎症靶点的作用，起到抗炎作用。主要成分与AKT，TNF，PI3KCG的对接3D图谱如图9～11所示。

表4 主要药物成分与蛋白受体的结合能表Tab.4 Binding energy table of major drug ingredients and protein receptors

图9 药物主要活性成分与AKT1（PDB：6HHI）的分子对接；用PyMOL软件显示3D图谱Fig.9 Main active ingredients were docked with AKT1（PDB：6HHI）molecules；Display 3D atlas with PyMOL software

图10 药物主要活性成分与PIK3CG（PDB：6AUD）的分子对接；用PyMOL软件显示3D图谱Fig.10 Main active ingredients were docked with PIK3CG（PDB：6AUD）；Display 3D atlas with PyMOL software

图11 药物主要活性成分与TNF（PDB：3KMC）的分子对接；用PyMOL软件显示3D图谱Fig.11 Main active ingredients of the drug were docked with TNF（PDB：3KMC）；Display 3D atlas with PyMOL software

3 讨论

KOA应用中医药治疗研究取得了一些重要进展，对指导与改善中医药临床应用有着积极的作用。KOA核心病机以肝肾亏虚为本，气滞血瘀为标，肾虚血瘀为主贯穿始终，BHD以补肾壮筋，活血止痛为主，对肾虚血瘀型颇具良效。《灵枢·刺节真邪》言：“虚邪之中人也……其入深，内搏于骨，则为骨痹……留而不去，则痹。”阐明肾主骨生髓，为先天之本；若先天禀赋不足，或后天耗损太过，则精不足，精不足则无以化生气血，肾亏髓少，则气虚血瘀，筋脉淤阻，内博于骨，则发骨痹。肾主藏精，在体合骨，故肾精亏虚，骨失所养，可致腰膝酸痛。《黄帝内经》曰：“气行则血行，气滞则血瘀。”气机运行不畅则脉道不利，不通则痛，言膝痹之标在于血瘀，故治疗肾虚血瘀型KOA当以补肾活血为大法。据此提出使用《伤科大成》补肾活血汤治疗，直指根本。多项研究表明，补肾活血的中药具有明确的降低血清、关节软骨及滑膜部位的NO含量，以及减少脂质过氧化的程度，从而达到缩短病程、保护软骨细胞和降低退行性病变速度的作用。

通过应用网络药理学方法，提取出BHD中482种疾病基因和533个药物靶点，将其与KOA疾病靶点数据库进行交集从而得出82个有效靶点，使用PPI网络结合STRING平台进行分析并得出关键靶蛋白共36种，靶蛋白平均节点度值为22.4，包括 TNF、AKT1、MMP9、IL1B、PTGS2、CASP3、MMP2、MAPK8等。再对以上关键靶点构建分析网络，以蛇床子素、川白芷素、二氢山芹醇醋酸酯、伞形酮、阿魏酸松柏酯、东莨菪亭、洋川芎内酯A、阿魏酸、佛手苷内酯、藁本内酯为度值排名前10成分。现代药理学研究发现以上化合物抗菌、抗氧化、镇痛抗炎活性、抗老化、舒张血管及抗微生物活性等作用明显[4]。蛇床子素是抗炎镇痛主要成分，能够有效地改善骨代谢水平[5-7]，通过抑制IL-1β等炎症介质的释放发挥保护KOA软骨组织的作用，可作为下游靶点的调控分子调控机体的炎性反应，降低PI3KCG/AKT信号通路关键蛋白PI3KCG、AKT蛋白的表达[8]；通过抑制MAPK的磷酸化和MMP活性，从而抑制TNF基因的表达，达到治疗KOA的作用[9]。川白芷素对内毒素诱导的巨噬细胞有一定阻断作用，从而发挥一定的抗炎功效。Ouyang等[10]研究表明，伞形酮治疗OA疗效显著，通过抑制MAPK信号通路可能是其治疗OA的潜在靶点。东莨菪亭可通过MAPK信号通路抑制IL-6的产生而达到改善软骨降解、软骨细胞存活、软骨内稳态和软骨下骨结构的完整性，从而减轻KOA的进展和关节软骨结构。佛手苷内酯可通过减轻磷酸三钙磨损颗粒诱导的内质网应激及PERK通路活化而阻止骨细胞凋亡[11]。研究表明，洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、阿魏酸等化合物与抗血小板聚集活性相关性大，有效促进新血管形成有效物质，舒张血管。藁本内酯还可通过抑制癌细胞生长、血管平滑肌细胞过度生长达到镇痛消炎作用[12]。以上表明BHD可能通过本次筛选的主要药物成分作用于AKT、TNF、PI3KCG等靶点达到治疗KOA，分子对接结果亦显示上述化合物潜在调节炎症靶点的作用，保护软骨及其环境，改善骨代谢，改善血流动力，改善微循环，从而达到补肾活血之效。

KOA的发病机制是由于关节内环境发生变化，存在过多的炎症因子而诱发，其治疗思路在于调节关节内的炎症因子浓度[13]。根据GO富集分析生成的119个GO条目的结果，证明BHD中的活性成分可以在人体细胞质、细胞液、微绒毛等多处细胞部位对炎症反应起到调控作用，其涉及过程包括细菌防御反应、信号通路刺激或阻断等。据KEGG富集分析的结果，BHD治疗KOA的关键靶点数量为36，其涉及到的信号通路主要包括TNF和HIF-1信号通路，类风湿性关节炎，破骨细胞分化，PI3K-Akt信号通路等信号通路。Sandra等[14]研究发现TNF因子过量可激活胰蛋白酶原，继而对软骨细胞形成过度刺激从而导致软骨部位发炎坏死，可刺激滑膜周围血管导致滑膜腺体萎缩而导致关节肿胀间接影响KOA的发生。Wang等[15]研究使用IL-1Ra和可溶性的TNF受体，可协同抑制TNF-α从而延缓关节炎的发展。HIF信号通路是低氧反应信号之一，通过诱导产生HIF-1α并激活下游相关的基因，刺激破骨细胞分化而引起KOA；PI3K-AKT信号通路亦可促进HIF-1的表达及其稳定[16]。Li等[17]研究表明MAPK信号通路的激活与OA中软骨细胞凋亡、炎症及胶原蛋白降解过程相关；亦可通过介导调控骨性关节炎软骨病变的信号转导系统，其相关信号通路的激活可改变基质金属蛋白酶的表达，诱导MMP-13的表达，导致软骨特性的Ⅱ型胶原进行性降解，从而调控软骨细胞的细胞凋亡及骨破坏等一系列反应，影响KOA的发生与发展，并调节细胞的炎性反应[18-19]。PI3K-AKT信号通路由多种因素激活，并参与多种下游细胞因子、炎症介质如TNF-α等的基因转录[20]，对于关节炎症有激发和加重的作用。在大量软骨细胞发生损伤时，PI3K激活并令AKT磷酸化，阻止软骨细胞的凋亡过程，达到对KOA的治疗作用[21]。由此推测，BHD可能通过活性成分作用于TNF，AKT1，MAPK等关键靶点，激活或抑制TNF，破骨细胞分化，PI3K-Akt等多条信号通路，通过调节细胞代谢、增殖与凋亡和促进血管生成等过程，达到提高免疫力、逐步改善关节内环境和抑制炎症的目标，达到治疗效果。

综上所述，文章通过研究，将大量的数据使用网络药理学方法整合与分析，应用分子对接技术对其靶点进行验证，构建BHD治疗KOA的靶点交互作用的网路图，将现代医学方法与中医整体观契合，为中医药的发展研究开辟新思维。网络药理学作为近几年来中医药研究的一个新兴领域，将传统中医复方通过多学科交叉研究，构建“药物-成分-靶点”网络，探索药物与机体相互作用的途径。微观水平阐明BHD通过多靶点、多通路从抗炎、抗氧化、调节细胞增生、细胞凋亡及新血管生成等方面发挥治疗KOA的潜在机制，为BHD的临证提供微观依据。后续可深入研究BHD中药的化学成分复杂性，应用具有高分离、高分辨的高效液相色谱仪，并对中药的提取物成分进行定性鉴定，为复方中药中所含化学成分进行鉴别。应用液质联用定性分析方法，可进一步验证复方中的活性成分和全定性分析思想实际的可行性，为阐明中草药的物质基础提供有力支持，可更深层次验证网络药理学中所筛选出的药效靶点成分[22-23]。