高效液相色谱法测定复方甘草口服溶液中8 种防腐剂

2022-07-29曾庆花黄慧杨娜李智明邓鸣

化学分析计量 2022年7期

曾庆花，黄慧，杨娜，李智明，邓鸣

(广西食品药品检验所，南宁 530021)

复方甘草口服溶液是由甘草流浸膏、复方樟脑酊、甘油、愈创甘油醚、浓氨溶液及水混合制成[1]，主要用于上呼吸道感染、支气管炎和感冒引起的咳嗽以及咳痰不爽，是临床上常用的祛痰镇咳药[2]。复方甘草口服溶液中的复方樟脑酊含有防腐剂苯甲酸。防腐剂作为药物制剂中重要组成部分，在防止药品被微生物污染、确保药品质量方面起着重要作用。由于防腐剂具有一定的毒性，因此《中国药典》(2020 版)通则对防腐剂的品种与用量作了具体规定，如山梨酸和苯甲酸的用量不得超过0.3%(其钾盐、钠盐的用量分别按酸计)，羟苯酯类的用量不得超过0.05%[3-5]。

测定复方甘草口服溶液中苯甲酸含量的方法已有文献[6]报道，但因国内复方甘草口服溶液生产企业所加防腐剂的种类与用量不同，为有效筛查复方甘草口服溶液中防腐剂是否符合《中国药典》限量要求，笔者参考文献[7-16]，对色谱条件进行优化，建立了高效液相色谱法同时测定复方甘草口服溶液中苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯8 种常见防腐剂。该方法具有样品处理简单，分离效果好等特点，可用于复方甘草口服溶液中多种防腐剂的筛查和同时测定，为其质量评价提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters e2695 型，配有Empower 2工作站，美国Waters 公司。

电子天平：XS205DU 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

乙腈：色谱纯，德国默克股份有限公司。

苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯8 种防腐剂对照品：具体信息见表1，中国食品药品检定研究院。

表1 8 种防腐剂含量和批号

乙酸铵、冰乙酸：均为分析纯，中国医药集团有限公司。

复方甘草口服溶液：市售。

实验用水为去离子水，由密理博纯水仪制得。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：SHISEIDO CAPCELL MG ⅡC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本资生堂公司)；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：苯甲醇、苯酚为211 nm，苯甲酸为225 nm，山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯为256 nm；流动相：A 为乙腈，B 为20 mmol/L 乙酸铵溶液(用冰乙酸调节溶液pH 5.0)，流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序1）

1.3 溶液配制

1.3.1 8 种防腐剂混合对照品储备液

分别称取苯甲醇、苯酚、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯对照品适量，用甲醇溶解并稀释成8 种防腐剂质量浓度分别为8.0、3.0、3.0、3.0、0.5、0.5、0.5、0.5 mg/mL 的混合对照品储备液。

1.3.2 8 种防腐剂系列混合标准工作溶液

精密移取8 种防腐剂混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别置于7 只100 mL容量瓶中，用50%(体积分数，下同)甲醇溶液稀释至标线，配制成苯甲醇质量浓度分别为8.0、16.0、40.0、80.0、160.0、400.0、800.0 μg/mL，苯酚、苯甲酸和山梨酸的质量浓度均分别为3.0、6.0、15.0、30.0、60.0、150.0、300.0 μg/mL，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的质量浓度均分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的系列混合标准工作溶液。

1.3.3 样品溶液

精密移取复方甘草口服溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，经0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.4 实验方法

取8 种防腐剂系列混合标准工作溶液及样品溶液，按1.2 仪器工作条件进样分析，建立8 种防腐剂的标准工作曲线，计算线性方程，利用标准曲线法计算样品中防腐剂的含量。

2 结果与讨论

2.1 仪器工作条件选择

2.1.1 流动相

参考文献[7-16]，分别对甲醇-水、甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(用冰乙酸调节至pH 5.0)、乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(用冰乙酸调节至pH 5.0) 4 种流动相进行考察，结果表明，采用甲醇-水、乙腈-水为流动相时，苯甲醇、苯甲酸、山梨酸不能有效分离；采用甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵溶液为流动相时，样品溶液中其它成分对山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯的测定有干扰；而采用乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液为流动相时，通过优化梯度洗脱程序，可使各成分实现良好的分离，色谱峰形良好，且样品溶液中其它成分对测定无干扰，故选择乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(用冰乙酸调节至pH 5.0)为流动相。以乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(用冰乙酸调节至pH 5.0)为流动相，在不同分析波长下，8 种防腐剂混合标准溶液和加标样品溶液的色谱图分别如图1、图2 所示。

图1 不同分析波长下8 种防腐剂混合标准溶液色谱图

图2 不同分析波长下加标样品溶液色谱图

2.1.2 检测波长

采用二极管阵列检测器在200～400 nm 波长范围内分别对8 种防腐剂进行扫描，结果发现，苯酚分别在211、270 nm 处有最大吸收，苯甲醇分别在213、257 nm 处有最大吸收，苯甲酸分别在225、269 nm 处有最大吸收，山梨酸与对羟基苯甲酸酯类的最大吸收波长均为256 nm。考虑苯甲醇、苯酚、苯甲酸分别在257、270、269 nm 波长处响应值较小，故选择211 nm 作为苯甲醇、苯酚的测定波长，225 nm 作为苯甲酸的测定波长，256 nm 作为山梨酸和对羟基苯甲酸酯类的测定波长。

2.2 线性方程与检出限

按1.2 仪器工作条件分别测定1.3 中的8 种防腐剂系列混合标准工作溶液，以待测防腐剂质量浓度为横坐标(x，μg/mL)、色谱峰面积为纵坐标(y)，分别绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。取系列混合标准工作溶液中质量浓度最小的溶液，用50%甲醇溶液逐级稀释，按1.2 仪器工作条件测定，并记录色谱峰面积，分别以3 倍信噪比和10 倍信噪比对应的质量浓度作为各种防腐剂的检出限和定量限。8 种防腐剂质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。

表3 质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.3 加标回收与精密度试验

采用向样品中加入标准溶液的方式进行加标回收试验。精密吸取同一批复方甘草口服溶液样品0.4、0.5、0.6 mL 各3 份，分别置于100 mL 容量瓶中，分别对应加入8 种防腐剂混合对照品储备液0.4、0.5、0.6 mL，用50%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，作为低、中、高3 种质量浓度水平的加标样品溶液，在1.2 仪器工作条件分别进行测定，计算回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表4。由表4 可知，8 种防腐剂加标回收率为98.3%～105.1%，测定结果的相对标准偏差为0.8%～6.5%。表明该方法测量准确度和精密度良好，可用于复方甘草口服溶液中防腐剂的检测。