液相色谱–光谱图法定性确证食品中苯甲酸、山梨酸

2022-01-27马长海于明明闫吉昌辛若竹

化学分析计量 2022年1期

马长海，于明明，闫吉昌，辛若竹

（1.白城市产品质量检验所，吉林白城 137000；2.梅河口市食品药品检验检测中心，吉林梅河口 135000）

目前，苯甲酸和山梨酸是食品中应用最广泛的防腐剂，由于其防腐效果好，价格便宜深受食品加工业的青睐，但苯甲酸和山梨酸超标、超范围使用会对人身健康造成一定程度的损害。GB 2760—2014 《食品添加剂使用标准》［1］中严格规定了苯甲酸和山梨酸的使用范围和使用限量，并且我国已将苯甲酸和山梨酸列为食品安全日常监测的必检项目。目前苯甲酸和山梨酸的主要检测方法有液相色谱法［2–8］、气相色谱法［8–10］和超高效液相色谱–串联质谱法［11–12］，其中液相色谱法因其设备适用性好、检测成本低、样品前处理简单而成为首选检测方法。由于色谱分析是以色谱峰的保留时间定性，而食品种类繁多且基质复杂，同一保留时间常有干扰峰出现，且苯甲酸、山梨酸的保留时间常受样品溶液pH 值的影响有所波动［13–14］，因此苯甲酸、山梨酸除了以保留时间定性外，还应根据不同物质具体光谱特性，利用光谱信息进一步定性确证［15–16］，避免出现假阳性样品。

笔者在GB 5009.28—2016 《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》的基础上，当色谱图中出现干扰峰或可疑峰需要定性确证时，利用液相色谱仪DAD 检测器全光谱扫描功能分别采集标准溶液和样品溶液的光谱图，通过比较标准溶液中苯甲酸、山梨酸的光谱图与样品溶液中可疑峰光谱图的重合性，进一步定性确证样品中可疑色谱峰是否为苯甲酸、山梨酸，避免了实际工作中因定性失误而出现误判的事件。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 型，DAD 检测器，美国安捷伦科技有限公司。

涡旋混合器：重载数显型，转速为300～3 500 r/min，美国Talboys 公司。

超声波清洗器：KQ–500DE 型，江苏昆山市超声仪器有限公司。

高速冷冻离心机：KH20R–Ⅱ型，湖南凯达科学仪器有限公司。

甲醇：色谱纯，美国飞世尔科技公司。

甲酸：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

乙酸铵：优级纯，英国阿法埃莎化学有限公司。

苯甲酸、山梨酸标准物质：质量分数分别为99.9%、99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。

食品样品：干豆腐，白腐乳，酱油，蛋糕，面包，冷面，酱卤猪头肉，市售。

实验用水均为超纯水（电阻率为18 MΩ·cm）。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC–C18柱(150 mm×3.0 mm，2.7 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：2 mmol/L 甲酸与20 mmol/L 乙酸铵混合溶液–甲醇（95∶5，体积比，下同），流量为0.4 mL/min；分析波长：230 nm；DAD 检测器全光谱采集：波长范围为190～400 nm，步进值为2.0 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

1.3 溶液配制

2 mmol/L 甲酸与20 mmol/L 乙酸铵混合溶液：称取1.54 g 优级纯乙酸铵，用适量水溶解，再加入75.2 μL 甲酸，用水定容至1 000 mL，经0.22 μm水相滤膜过滤后备用。

数据中心总耗电量的测量可将M1点和M2点测得的耗电量相加。大多数数据中心的供电系统会配备柴油发电机，作为应急备用电源，而柴油发电机工作时也会带来电能的损耗，该损耗不能被忽略。因此，数据中心总耗电的测量应包含市电和柴油发电机两部分。而数据中心中往往会附带一些配套设施，如办公，这部分功能所消耗的电量不应计入PUE的范围内，因此M4点测出的电量应以扣除。

苯甲酸、山梨酸标准储备溶液：质量浓度均为1 mg/mL，分别准确称取苯甲酸、山梨酸各0.01 g，用甲醇溶解并分别定容至10 mL。

苯甲酸、山梨酸混合标准中间溶液：各组分质量浓度均为100 μg/mL，分别准确吸取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各5.0 mL 于50 mL 容量瓶中，用水定容。

苯甲酸、山梨酸混合标准使用液：各组分质量浓度均为10 μg/mL，准确吸取苯甲酸、山梨酸混合标准中间溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容。

1.4 样品处理

准确称取食品样品2 g 于50 mL 具塞离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，超声20 min，加92g/L亚铁氰化钾溶液2mL和183g/L乙酸锌溶液2mL，混匀，以8000 r/min 离心5 min，将水相转移至50 mL 容量瓶中，于残渣中加水20 mL，涡旋混匀后超声5 min，以8 000 r/min 离心5 min，将水相转移到同一50 mL 容量瓶中，并用水定容至标线，混匀。取适量上清液，过0.22 μm 滤膜，待液相色谱测定。

1.5 定性分析

向液相色谱仪中分别进样苯甲酸、山梨酸混合标准使用液和样品溶液各10 μL，经色谱柱分离后，于230 nm 波长下检测，在以保留时间定性，并利用DAD 检测器全光谱扫描功能分别采集苯甲酸、山梨酸混合标准溶液及样品溶液的光谱图，通过比较混合标准溶液中苯甲酸、山梨酸的光谱图与样品溶液中可疑峰光谱图的重合性（光谱图信息），进一步定性确证样品中可疑峰是否为苯甲酸、山梨酸。

2 结果与讨论

2.1 苯甲酸、山梨酸混合标准溶液色谱图

参照文献［8］的色谱条件，以Agilent Poroshell 120 EC–C18色谱柱分离，以2 mmol/L 甲酸与20 mmol/L 乙酸铵混合溶液–甲醇（95∶5）为流动相洗脱，于230 nm 波长检测，苯甲酸、山梨酸混合标准溶液色谱图如图1 所示。由图1 可知，苯甲酸、山梨酸的色谱保留时间分别为9.169、17.782 min。

图1 苯甲酸、山梨酸混合标准溶液色谱图

2.2 样品中苯甲酸、山梨酸定性确证

分别选取市售代表性食品干豆腐、白腐乳、酱油、蛋糕、面包、冷面、酱卤猪头肉共7 种样品，按照1.4 方法进行样品处理，在1.2 色谱条件下分别采集色谱图和光谱图，如图2～图12 所示。将样品与苯甲酸、山梨酸混合标准溶液色谱图、光谱图相比较。以保留时间定性，由色谱图中可知：干豆腐中检出苯甲酸和山梨酸色谱峰（图2）；白腐乳中检出苯甲酸色谱峰，未检出山梨酸色谱峰（图3）；酱油中检出苯甲酸色谱峰，未检出山梨酸色谱峰（图4）；蛋糕、面包、冷面中均检出山梨酸色谱峰，未检出苯甲酸色谱峰（图5）；酱卤猪头肉中检出苯甲酸色谱峰，未检出山梨酸色谱峰（图6）。

图2 干豆腐样品色谱图

图3 白腐乳样品色谱图

图4 酱油样品色谱图

图5 蛋糕、面包、冷面样品色谱图

图6 酱卤猪头肉样品色谱图

图7、图8 分别是苯甲酸、山梨酸混合标准溶液的苯甲酸、山梨酸光谱图。通过对比可知：干豆腐中苯甲酸光谱图与苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中苯甲酸光谱图完全重合，山梨酸光谱图（图9）完全不重合（峰起点、峰顶点和峰落点均不同），可确证干豆腐中苯甲酸为阳性，山梨酸为假阳性；白腐乳苯甲酸光谱图与苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中苯甲酸光谱图（图10）完全不重合（峰起点、峰顶点和峰落点均不同），可确证白腐乳中苯甲酸为假阳性；酱油中苯甲酸光谱图与苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中苯甲酸光谱图完全重合，可确证酱油中苯甲酸为阳性；蛋糕、面包、冷面3 种样品中山梨酸光谱图均与苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中的山梨酸光谱图完全重合，可确证3 种样品中山梨酸均为阳性；酱卤猪头肉中苯甲酸光谱图与苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中苯甲酸光谱图（图11）完全不重合（峰起点、峰顶点和峰落点均不同），可确证猪头肉中苯甲酸为假阳性。

图7 苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中苯甲酸光谱图

图8 苯甲酸、山梨酸混合标准溶液中山梨酸光谱图

图9 干豆腐样品山梨酸光谱图

图10 白腐乳样品苯甲酸光谱图

图11 卤酱猪头肉样品苯甲酸光谱图

2.3 样品数据分析与质量判定

将上述样品中苯甲酸、山梨酸的定性、定量结果列入表1。

表1 样品中苯甲酸、山梨酸定性、定量结果

由表1 可知，由于样品基质复杂，单一以保留时间定性，容易出现假阳性情况（如干豆腐中山梨酸，白腐乳中苯甲酸、猪头肉中苯甲酸均为假阳性）；而根据保留时间和光谱图信息两方面进行综合分析定性，才能保证样品检测结果更加准确、可靠。根据GB 2760 规定，豆类制品中不得使用苯甲酸，干豆腐样品中苯甲酸含量为0.029 g/kg，故判定为不合格样品；小麦粉制品中不得使用山梨酸，冷面中山梨酸含量为0.015 8 g/kg，故判定为不合格样品；其余样品白腐乳、酱油、蛋糕、面包、猪头肉中苯甲酸、山梨酸含量均符合GB 2760 规定，判定为合格样品。